[求救] PCR找不出的盲點

[ttgsh (寶)]

遇到PCR的問題
一開始利用dream tag有P的所要的產物
但之後用相同條件，相同機器
就P不到任何東西

PCR產物約2000bp

PCR配方
水          18ul
10x buffer  2.5ul
10mM dNTP   1ul
primer(F)   1ul
primer(R)   1ul
Dream tag   0.5ul
cDNA        1ul

PCR條件:94度   5min
        94     30sec
        55/50  30sec
        72     2min
        72     10min
        4
 Run 35 cycle

目前試過改進的方法有1.增加cDNA的量變成2ul及3ul
                    2.降低annealing temperature(EX.55度降為50度)
                    3.換成2X Master mix的tag
                    4.換新的cDNA試過~也不行 > <

(sample,primer,水,buffer,PCR machine都一樣)
請教各位厲害人士
還有什麼地方可以改進的??
還是有什麼方法??
謝謝~!



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.90.143
→ huuban:cDNA回溶幾次了？
→ a0946113:primer的濃度是?
→ nike77114:把P過的Products再拿去P一次試試看
→ mzac1b:感覺你是要construct 我覺得你的改進方式太客氣了 @.@
→ mzac1b:2ul-->3ul 才1.5 倍 沒啥感覺... annealing 才換一種溫度..
→ mzac1b:但我覺得cDNA 濃度倒不關鍵 除非degrade 光光 那再多也沒用
→ mzac1b:狠一點就跑gradient50~70，cycle 40甚至60也ok 反正就硬p
→ mzac1b:溫度也不一定降低就比較容易p 出來
→ ttgsh:cDNA回溶約三次，primer是10uM
→ ttgsh:p過的產物有在去p過~ 是有p出來~ 但是產物用完了就再也P不出
→ ttgsh:我是要做construct沒錯~
→ ttgsh:但50度已經是實驗室可以接受的最低溫度了
→ ttgsh:所以溫度不能再低了> <
→ ttgsh:現在就是硬p也p不出來~
→ ttgsh:而且之前在55度有p出來，可是之後都P不出來
※ 編輯: ttgsh           來自: 163.25.90.143        (12/19 14:31)
推 leoblack:你的水是滅過菌的水嘛?!
→ huuban:有看過cDNA做不好結果用沒幾次就掛掉的
→ keyray:依經驗來看.應該要先確認一下cDNA是否有出問題
→ keyray:畢竟p過的產物有p出來,就可以排除掉condition的問題
→ a0946113:cDNA跑個control看看
→ ttgsh:水是滅過的呀!!!
→ ttgsh:嗯嗯~ 謝謝!! 我會先確認cDNA是否有問題~
→ jsi:enzyme還健在嗎? PCR都沒有做positive control嗎?
→ huuban:推樓上，其他positive control都ok嗎？
推 afresh72:奇怪，怎麼都沒有人懷疑你的primer是不是設計有錯誤嗎？
→ afresh72:建議你再找人幫你確認看看你的primer有沒有錯。
→ afresh72:另外，有些公司訂製的primer也可能出錯，就P不出產物。
→ blence:樓上沒看到原po先有P到,相同條件後來卻失敗,怎會懷疑primer
→ wangba:primer有沒有可能degrade?
→ ttgsh:enzymeg是新開封的~ 應該是不會有問題
→ ttgsh:control有做過~ 也都OK!!
→ ttgsh:是基因全長不知為何突然p不出來~
→ ttgsh:但換成同基因產物較短的primer就可以p出來~
→ a90648:這樣看來應該是舊primer掛掉了吧
→ a90648:既然想找出哪邊有錯，能換新的就應該全換過啊
→ ttgsh:能換新的我都換過了沒錯~ primer也重新回溶過
→ ttgsh:所以想說先重新抽RNA轉cDNA試試
推 dennisyoung7:把elongation的時間從兩分鐘加長到兩分半或三分鐘呢?
推 mfliymh:我遇過PCR buffer壞掉...