[求救] plaque assay

[ennnnno (伊諾)]

最近做plaque assay遇到很大的問題

每次加完病毒液後細胞都會飄浮=__=

有的well會有的不會,我好難控制他!為什麼為什麼呢???

protocol如下:

1. seeding RD cell 4*105/ml到 6 well plate, 於5% CO2,37℃下培養24hr
2. 將病毒液稀釋至10-1~10-8。
3. 移除6well中的上清液後,加入稀釋好的病毒液,一個well加400μl
4. 加入病毒液後,每15min 用手搖晃一次,使病毒液均勻分佈,1hr
5. 加入2ml含methyl cellulose的DMEM medium
6. 37℃培養3~4 day
7. 觀察有plaque形成後,去除上清液,加10% formaldehyde (2ml/well)
8. 室溫放30min,去除上清液
9. 加1% crystal violet,室溫放30min
10.ddH2O wash,air dry,計數

Methyl cellulose DMEM:
2x DMEM中含4%的P/S和4%FBS,再和1%的Methyl cellulose以1:1混合

想要請問的問題有:
1.病毒要dilute至medium中時,medium需要先warm好嗎?

2.我都是很小心的將病毒液從well的邊邊加進去的,一開始加進去沒事,等一會再看,
  就會有細胞飄起來,然後實驗就失敗了,我是不是哪裡沒做好呢?而且細胞飄起來
  的地方並不是我加入病毒液的地方,所以應該也不是我沖的太大力而導致飄起

3.要加入含methyl cellulose的DMEM時,病毒液要吸起來嗎?

4.plaque的形成點要怎麼抓??是看到有一點plaque形成就ok嗎?

謝謝`

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.249
推 leoblack:要把沒attach成功的病毒洗掉才加cellulose不是嘛?
推 jabari:細胞青春嗎?繼代方式?可惜RD我不熟@w@ 可以改用低溫agarose
→ jabari:http://ppt.cc/DvGt <-pdf 有人試RSV 在vero用agar比較優
細胞是21代的,繼代方式是指?就是用trypsin處理後會加medium,然後離心
取一點細胞maintain,細胞我是拿別人家做plaque assay ok的細胞
可是都找不出原因,為什麼別人家都做的起來但我做不好@@
也去別人的實驗室看過操作,其實都差不多啊
所以才想說上版詢問有沒有奇怪的解決之道還是有更多需要注意的

推 paua:3. 要，要不然你的cellulose就被不均勻的稀釋了
→ paua:4. 依細胞和病毒而定，你可參考相關論文，若沒得參考。
→ paua:那就大約過24, 36, 72小時去觀察，待明顯的plaque形成，
→ paua:但又不能大到變成兩三個plaques黏在一起
→ paua:要不然會很難計數喔~
→ paua:1. 我用4度培養液; 2. 因為跟你使用的RD細胞不熟，所以不曉得
※ 編輯: ennnnno         來自: 111.255.177.203      (01/09 00:32)