[求救] WB後壓出來的band很weak

[jajshigogo (唉唷喂~)]

最近在做WB, protein濃度已經下到200ug了,
結果band還是很weak, 就算是壓tubulin, 也不是很明顯

步驟大概是跑完gel將protein transfer到PVDF membrane後,
用1:5000下一抗(兩種抗體同時壓, 其中一個是tubulin),
室溫作用30-60min, 冰4度o/n,

隔天在下二抗, 室溫作用60min,
再壓片(1小時和2小時)

請問各位大大 是哪裡出了問題?
還是因為抗體壞掉了??

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◆ From: 120.114.181.198
推 qiet:2nd Ab titer?
推 alaric:先檢查tansfer效率, 個別一抗先試合理titer, 再抓二抗titer
→ alaric:舊片, 先用新配二抗再試看看, 不行, 往回檢查.
→ blence:用200ug的超多量,又壓片只有1,2h兩時間點,我猜band早燒掉了
→ jsi:先跟別人借ECL來用用
推 im9527tw:也有可能是顯影劑跟定影劑失效
→ joseph103331:燒掉了吧....壓tubulin從沒超過1分鐘
→ roy047:200ug tubulin不可能壓不爆qq   也可跟別人借抗體試試
→ roy047:也可檢查或重配transfer buffer或TBST 看是否壞掉才壓不到
推 datro:你tubulin應該是燒掉了吧!!
→ Ice9:washing condition 呢？會不會洗太久或搖太大力了點兒？
→ newmankind:有沒有想過是不是一開始protein定量就有問題
→ newmankind:換句話說就是你認為你下到200，其實因為定量時沒有扣掉
→ newmankind:background，讓你高估了protein量
→ newmankind:會提出這個問題是因為有些測定protein量的KIT
→ newmankind:在某些物質存在下，會影響讀值