推 captdavince:thank you!! 01/14 22:29
推 qiet:好文推~晚點在來仔細看 01/15 08:26
現在回有點久了，不過因為我最近跑了快 20 次的 454。
(抽 gDNA，library 製備，[emulsion PCR，enrichment，上機]
其中 [] 部分不斷 cycle....)
我想以我對 454 的了解，我可以來解釋一下～～
※ 引述《lalakuku (黑鮪魚)》之銘言：
: 小弟上網查了些資料還是有些部分不太懂
: 以下問題:
: 1.待擴增的序列會在它的兩端各接上A B adaptor
: 那這兩個adaptor是如何判別要接在序列的哪一側?
: ex:A adaptor 接5' B adaptor 接3'
舊的 kit 或是你看 Nature 的原始 paper 會寫說有 A B 兩個 adaptors。
問題來了，怎麼確定你的 library 剛好兩端接 1A 1B?
這問題我剛做的時候也是納悶很久，後來我跑去看原始論文才豁然開朗。
有興趣知道的話，這部份請看原始 paper 的補充資料：
檔案名稱 nature03959-s3.doc，來自下面這篇
Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS et al. (2005)
Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.
Nature 437, 376-80.
裡面有提到:
The A and B adaptors differed in both nucleotide sequence and the presence
of a 5’ biotin tag on the B adaptor. The adaptor pairs were designed to
allow directional ligation to the blunt-ended, fragmented genomic DNA
(Adaptor A: CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG.
Adaptor B: /5BioTEG/CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG).
也就是說 B adaptor 有多接一個 biotin 在上面，原始 protocol 有一個
streptavidin 微珠純化的步驟，將有 AB 跟 BB 組合情形的 ligates 抓住。
之後 emulsion PCR primers 是針對 A 跟 B 設計的 pairs，BB 不會被放大，
所以最後 enrichment 也抓不來，最後只會有 AB 組合的 DNA insert 會被送去定序。
(Enrichment 是指經過 emulsion PCR 之後，一條 DNA 大約會變成 100 萬條，
然後利用磁珠與 enrichment primer 去抓那些有大量 DNA 的微珠，只有一條 DNA 的
微珠因為分子作用力太小，不會被吸付，只有被 PCR 成功放大的才會被 enrichment。)
不曉得這樣講你清不清楚，不過現在不這樣做了，現在使用一種叫 Y-shape 的 adaptor
，這個 adaptor 其實就是 A+B 但是 Y 的基部部分序列相同，所以黏在一起，ligation
的時候兩邊都黏上了一樣的 Y adaptors，但是其實兩股 DNA 會像下面這樣：
5'-A-DNA(+)-B-3'
3'-B-DNA(-)-A-5'
怎麼樣接都是剛好有 A 跟 B，只能說有些人實在太聰明了，這個 kit 現在叫做
Rapid library kit，詳細有興趣可以看下面這篇文章：
Zheng Z, Advani A, Melefors Ö, Glavas S, Nordström H, Ye W, Engstrand L,
Andersson AF (2011) Titration-free 454 sequencing using Y adapters. Nat
Protoc 6, 1367-76.
: 2.當被選定的序列與微珠結合，那微珠是利用何種方式
: 來篩選只與這條序列作結合？（資料上寫說一顆微珠只與一條特定序列接合）
: 那會不會有一顆微珠上接著很多序列的情形發生？要如何排除？
這個問題叫做 emulsion titration，先用小反應去抓出最後多少數目的微珠會被
enrichment，最好的 % 落在 10-20% 之間 (% 意思是 enrichment 之後的微珠除以
最初放入的微珠數)，也就是想要一條 DNA 配一顆微珠，有一條 DNA 你要放 10
到 20 顆微珠，以此類推。
但基本上微珠數量是 kit 裡頭固定的，你要做的就是算要放入多少數目的 DNA。
這部份需要製作 library 時就用 qPCR 把這個數量算準來。
經過 emulsion titration 之後，你會得到一個 "DNA 數目/微珠數目" 對應到最後
enrichment % 的比率，這個比值最好是會產生出 10-20% enrichment rate 為最佳。
所以簡單來說，一條 DNA 接上一個微珠，這樣的情形，是利用大量的微珠去稀釋掉
DNA 跟微珠的作用力而來的，10-20% 是 Roche 的實驗經驗法則，也就是說，90% 的
微珠都會被丟掉，沒有任何 DNA 在上面，但是剩下 10% 左右的微珠，上面會剛好有
一條 DNA，當然這是理想狀態，實際上還是會有一些微珠上面有好幾條的，但是比例
較少。
: 以上這兩個點我搞不太清楚詳情
: 請專業的鄉民們替我解答 謝謝>"<
以上～～
希望能讓大家多了解一點 454 的實際操作原理。
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