※ 引述《ennnnno (伊諾)》之銘言：
: 最近做plaque assay遇到很大的問題
: 每次加完病毒液後細胞都會飄浮=__=
: 有的well會有的不會,我好難控制他!為什麼為什麼呢???
: protocol如下:
: 1. seeding RD cell 4*105/ml到 6 well plate, 於5% CO2,37℃下培養24hr
感覺起來有點少 最後體積是多少? RD cell很大嗎?
: 2. 將病毒液稀釋至10-1~10-8。
你用什麼medium稀釋?
: 3. 移除6well中的上清液後,加入稀釋好的病毒液,一個well加400μl
我是用12 well BHK CELL 也是有移除上清液
但是
其實你可以試試不要移除上清液 然後讓他感染overnight 我們家也是有人這樣做
: 4. 加入病毒液後,每15min 用手搖晃一次,使病毒液均勻分佈,1hr
我覺得沒有必要 你要給病毒有時間沉降 這樣一直搖感染
能力就算不會降低 也不會比較高 有人甚至會用離心的方式
增加病毒的感染能力
如果你說要均勻分布比較好算plaque...
阿你都已經做到連續稀釋了 如果一格有幾十顆plaque分不開
應該做的是增加稀釋的倍數 而不是讓病毒"均勻分布"吧?
: 5. 加入2ml含methyl cellulose的DMEM medium
: 6. 37℃培養3~4 day
長蠻快的嘛
: 7. 觀察有plaque形成後,去除上清液,加10% formaldehyde (2ml/well)
: 8. 室溫放30min,去除上清液
: 9. 加1% crystal violet,室溫放30min
: 10.ddH2O wash,air dry,計數
: Methyl cellulose DMEM:
: 2x DMEM中含4%的P/S和4%FBS,再和1%的Methyl cellulose以1:1混合
: 想要請問的問題有:
: 1.病毒要dilute至medium中時,medium需要先warm好嗎?
其實是不用 低溫只是讓病毒進入細胞的動作暫停
但是一回溫病毒就會鑽進去了 有的人會用這個
原理作同步化的實驗
: 2.我都是很小心的將病毒液從well的邊邊加進去的,一開始加進去沒事,等一會再看,
: 就會有細胞飄起來,然後實驗就失敗了,我是不是哪裡沒做好呢?而且細胞飄起來
: 的地方並不是我加入病毒液的地方,所以應該也不是我沖的太大力而導致飄起
有可能是你用來稀釋的medium有問題
: 3.要加入含methyl cellulose的DMEM時,病毒液要吸起來嗎?
沒在吸 不過我是 12well 180ul virus + 2ml methyl cellulose
: 4.plaque的形成點要怎麼抓??是看到有一點plaque形成就ok嗎?
: 謝謝`
拿起來透光看 會看到一坨一坨的細胞疊起來 那就是plaque
固定以後一沖就掉了
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