[求救] western ECL反應條件

[domoto01 (Chia)]

有關western最後一步以冷光呈色劑ECL反應，我們家得做法是：
洗好2抗的膜會放在已剪開得自黏式塑膠膜上，
然後以p1000 pipetman吸取3ml得ECL試劑來回均勻淋在膜上，
最後把塑膠膜蓋上，反應2~5分鐘後，將ECL試劑擦拭乾淨，
再使用冷光照相系統(UVP)偵測。

~問題來了~

老師每次看到結果圖都會嫌棄我們是不是ECL沒有淋均勻= =
操作給老師看之後，老師說我淋太快了這樣不行。
因此第二次照着老師建議得速度做了一次，覺得還是很難控制> <
結果還是會有某一區塊比較暗的情形，好像那一塊淋到得ECL比較少的樣子
我們家使用得ECL試劑是millipore的2合1那種。

我想請問大家ECL也是用淋得嗎?有什麼訣竅可以做好這一步?
不然辛苦鑄膠跑膠轉印完hybrid完抗體，
結果敗在最後一步實在很扼腕也很打擊信心呀T T

另外就是我有看過別的實驗室做法，
是像搖抗體那樣，把膜放在ECL裡面搖(反應)。
我想問問版上是否有人也是這樣子做得呢?想要參考看看這樣做該如何抓條件！

謝謝各位耐心看完我打得東西。
雖然WESTERN實驗變異很多，但因為這一步一直被老師complain，
我又超無解得，實在很苦惱。
有搜尋過版上western相關文章，但發現大家討論照不出東西比較多，
還有跑膠轉印條件之類得.....

最後希望大家實驗都能夠順利啦！謝謝各位^^

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圖片檔案網址在這邊，如果看不到請再和我說，謝謝各位(感恩)
http://ppt.cc/BT4h


◆ From: 219.84.253.154
推 alaric:你可以先將A,B液混合(使用前), 膜先放在面紙吸到無水漬,
→ alaric:再將膜移到乾淨的容器或保鮮膜上, 淋上ECL, 將膜完全蓋滿,
→ alaric:反應時間後, 可以再準備放到面紙上吸乾到無水漬,就封到膠膜
→ alaric:上述流程,已經好久沒用.現在都是直接在容器內呈色就去照相.
→ blence:3ml,這至少可以覆蓋8X6membrane好幾倍,你的很大張?millipor
→ blence:那一套反應時間應該1min就很夠了,反應太久容易燒掉反白
→ blence:沒圖,如果你的多餘ECL水滯有吸掉,說不定是2抗造成訊號不均
推 joseph103331:用搖的 8x6 cm 應該只要A+B 1~1.5 mL就搖得起來
→ joseph103331:這步我們通常用手搖 約3min左右
推 tsubasawolfy:拿個小盤子先把膜擺好後盤子斜個角度淋上去
→ tsubasawolfy:在吸取聚到盤子一角的ECL重複淋 要讓ECL均勻流過
→ tsubasawolfy:時間控制在30s-1min  之後把膜夾起來舔擦手紙 正反
→ tsubasawolfy:面都舔 保持濕潤但不要有流動的形狀就好
→ tsubasawolfy:而且M牌反應速度很快很強 泡到5分鐘都反應完了吧..
→ domoto01:to:blence 我使用的膜是9.5x5大小得。你說沒圖是指實驗結
→ domoto01:果圖嗎?
→ domoto01:我們在做的時候真的有反應5分鐘耶~主要會去調整曝光時間
→ domoto01:除非真得太強，就會知道ECL不能反應那麼久。這樣抓條件得
→ raiyu:可以附個圖嗎?
→ domoto01:請問用搖的時候是放在小盒子裡面搖還是封口袋之類的東西?
※ 編輯: domoto01        來自: 140.136.181.22       (01/23 12:29)
推 alaric:PCR盒的蓋子很好用.
→ domoto01:昨天學妹試做了，她用10ml重複使用，反應時間都是5min，
→ domoto01:照第三張的時候就已經有點弱了。和老師講的時候，他說ECL
→ domoto01:不要重複使用呀...今天下午meeting老師說要來討論ECL怎麼
→ domoto01:這一步驟怎麼做來減少實驗誤差= =
推 shiningspark:沒重複使用過耶，A+B 大概1.5 ml用手搖+1
→ domoto01:我的膜是9.5*5，1.5ml量好少膜根本淹不過，這樣搖會反應
→ domoto01:均勻嗎?請問shin大的膜大小是?
推 jasonstudio:我也用這款 基本上沾一下就可以去照了
→ jasonstudio:怕乾掉就在多滴幾滴在上面 最好是可以讓膜上一直有
→ jasonstudio:ECL試劑