Re: [求救] E.coli electroporation

[puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)]

※ 引述《shiningspark (阿冠)》之銘言：
: 請問各位
: electroporation如何避免電爆呢?
: 最近每電必爆
: 前陣子成功率還蠻高的，快氣死人了
: 實驗的條件為1900 V
: 約40 ul competent cell
: 加10 ul ligated plasmid
: 外觀看起來沒有氣泡，水滴也有擦乾
: plasmid量太多會有影響嗎?
: 或是plasmid體積太大影響電阻?
: cuvette也有放冰上預冷
: 但預冷是要把整根金屬部分都埋進去呢?
: 或是大概菌液會接觸到的部分就足夠?
: 還有其他可能失敗的原因嗎?
: 實在是電到很挫折啊...

.......

Ligation buffer裡面就是滿滿的鹽類

我們有兩個解決方法

1. Ligation結束先做酒精沉澱 最好加Glycogen東西才比較不會不見

2. 1 ul的ligation product+100ul competent cell

早期是用1, 但是太麻煩然後我現在用2

Ligation有成功的話 會長到整盤滿滿幾千顆colony
        沒         一顆都沒有 (不要跟我挑語病)

另外你電菌的電壓太高了 不用這麼高 我用1700V就很夠了

至於你說早期會成功 真的還蠻神奇的 我用1ul+50ul去電

電壓設定1700V 但都會電爆 你用10+40還可以電成功 可以

請問你用的是哪一家ligase嗎?


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 211.76.175.170
推 shiningspark:我們家用fermentas的T4 ligase喔
→ shiningspark:話說我們家之前的人都是10ul ligation product全部電
→ shiningspark:下去都OK說，不過他們大概用80ul competent cell就是
→ shiningspark:也許應該乖乖用80或100ul competent cell來電
→ puec2:這樣看起來fermentas的buffer配方比較特殊