[求救] 如何 PCR full-length cDNA?

[jjcs1001 (以平凡創造奇蹟！)]

嘗試了很多次
但全長始終P不出來(3045 bps)
奇妙的是，之前再做其他實驗有P出這個gene的3'端fragment(768 bps)
但現在老師要求保險起見，想要看全長蛋白的表現
但是我始終P不出來，有可能是template cDNA已經斷光了嗎?
還是我的primer設計有問題呢?
我全長兩端primer設計如下：

F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG"

R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG"

"  "內是與gene互黏的序列，"  "以外則是切位跟多留的bps

我的PCR條件是

94度  30'
55度  30'
72度  3"10'

老師說可以嘗試分段PCR再接起來，可是我查過，上面的切位真的很稀少，而且很冷門

我到底該怎麼辦?

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不要可憐自己，那是下等人做的事！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.116.25.86
→ blence:兩條" "的序列拿去blast無法共同對應到同一gene,甚至疑似的
→ blence:gene也不是3kpbs,是NCBI database不夠完整嗎？
→ shenhsu:如果沒切位要接也是可以blunt end接...但機率..XD
→ shenhsu:或者找找看有沒有TCTAGT這種 非單一enzyme的切位
→ shenhsu:TCTAGT可以一邊用XbaI一邊用SpeI接 我記還有其他這種序列
→ shenhsu:當然template也是問題..P長片段時抽RNA和轉cDNA品質都要好
→ darkdoor:有試過其他溫度PCR嗎?annealing temp 有點太高了...
推 alaric:用overlap PCR, 分段p出, 再PCR接起.
→ jjcs1001:請問樓上的前輩，是先分段overlap分段P出來之後，再把
→ jjcs1001:P出來的產物都加到同一管當成是template嗎?
→ shenhsu:加在一起後我們會先煮沸sample再讓它緩慢恢復室溫 再做PCR
推 jabari:RACE kit