※ 引述《jjcs1001 (以平凡創造奇蹟！)》之銘言：
: 嘗試了很多次
: 但全長始終P不出來(3045 bps)
: 奇妙的是，之前再做其他實驗有P出這個gene的3'端fragment(768 bps)
: 但現在老師要求保險起見，想要看全長蛋白的表現
: 但是我始終P不出來，有可能是template cDNA已經斷光了嗎?
: 還是我的primer設計有問題呢?
: 我全長兩端primer設計如下：
: F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG"
: R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG"
: " "內是與gene互黏的序列，" "以外則是切位跟多留的bps
: 我的PCR條件是
: 94度 30'
: 55度 30'
: 72度 3"10'
: 老師說可以嘗試分段PCR再接起來，可是我查過，上面的切位真的很稀少，而且很冷門
: 我到底該怎麼辦?
我不知道你使用的是哪一種 polymerase，
但是有些 polymerase 對於長片段的 DNA 效果很差。
如果你的 cDNA 是完好沒有問題的，
而且 primer 是正確的且不考慮 polymerase 的問題，
那還有一種可能，
就是你要 PCR 的序列屬於 GC-rich，
這種情況也很容易造成 PCR 幾乎沒有產物，
解決方法是 PCR 時加入 GC-rich 的 buffer，
這個 Buffer 應該很多公司都有在賣。
我之前的經驗，
相同的 PCR 條件下，
如果沒加 GC-rich buffer，
一個 2300 bps 的序列有產物，
可是 2800 bps 的序列就做不出來了，
那時還把 extension 的時間設定到 4 Min，
依然沒辦法做出 2800 bps 的那個序列，
後來加入 GC-rich buffer 後問題就解決了。
所以現在只要我的 PCR 的產物超過 2500 bp，
無論序列是不是 GC-rich，
我都會加入那個 Buffer。
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