[求救] HepG2 生長問題

[bread75312 (阿徐)]

培養方法-----

解凍:凍管自液態氮取出後迅速於37度解凍,拿出來後2分鐘內解凍完畢
     然後用pipete吸取放入flask中


培養:解凍後24小時換液將DMSO移除,之後接著養到flask內細胞九分滿


繼代:將舊medium移除,用PBS洗去殘餘medium,接著用trypsin-EDTA於37度作用1.5-2分鐘
               (trypsin買的時候是10X,使用時以1mlPBS對0.1ml稀釋)


     接著以一分二的密度分盤


每兩天會換一次MEDIUM

問題1>作用兩分鐘是否太久??板上有大大作用1分鐘即可??

問題2>medium目前使用DMEM,paper也有人用MEM或RPMI,請問有人養過覺得哪個好呢??

目前最大問題3>在解凍後至第二代都還可以,可是再到第三代後生長變得很慢甚至沒長
              但他也沒有浮起來或死亡,但好像會漸漸死亡
              請問是我的方法有問題嗎??
              因為前一陣子養都還好
              目前唯一的不同就是血清換了新的批號,trypsin 也換了一種
              這兩個會影響嗎??








實在是已經不知道怎麼辦了.....
請各位大人幫小的解答 (跪

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◆ From: 140.127.19.160
※ 編輯: bread75312      來自: 140.127.19.160       (02/27 18:24)
推 shiningspark:1.沒算時間，看到全融沒浮冰就會馬上拿出來
→ shiningspark:實驗看起來沒太大問題，跟鄰居交換血清試試看
→ tchan:DMSO在24小時後才移除？凍細胞時至少5%以上，我都2小時就換
→ tchan:或者說細胞貼盤以後就換，總之不會超過5小時才換就是了
推 im9527tw:我養HepG2步驟都跟你差不多,只是用的medium是RPMI,繼代時
→ im9527tw:甚至都是1x trypsin切10分鐘,沒有發生過不生長的情形
→ im9527tw:DMSO在24小時後才移除沒有問題喔,食工所也是這樣建議
→ im9527tw:還有生長緩慢或不生長也要考慮是否有Mycoplasma汙染
→ bread75312:感謝各位大人!! 小的還有思考是不是繼代數已達上限??
→ bread75312:因實驗室細胞株也都是從別的實驗是拿來養的
推 leptoneta:HepG2應該比較不會有繼代數的問題
→ tchan:重新看了一下，我覺得你先去確認到底medium是否用對，未經馴
→ tchan:化而使用錯誤的medium真的在養個兩三代以後就會開始很不健康
推 mandible:我覺得是血清~跟隔壁家借一下血清吧!
→ chvkimo:我在水浴解凍的時候 只要內容物會移動 就開始拿去操作台
→ chvkimo:操作後續步驟  不會等到全部融解 給你參考看看
推 kkelvin:我養HepG2 trypsin都切超久的耶 XD
→ bread75312:感謝各位解答!!會去試試看其他方法的!!