[求救] Roche Southern DIG

[joycenino (joycenino)]

大家好:

    想請教大家關於Southern DIG的實驗問題...

因為本實驗室尚無系統，我做了好幾次都只有marker跟positive control有雜合訊號..

我的材料是比較少人做的中草藥植物.."

用CTAB法抽取DNA

以下有幾個問題想請教大家..> <

1.植物gDNA的濃度 (這應該是最主要的問題..?)

  我之前都是用O.D值測DNA的濃度，同時也會跑膠check

雖然我知道O.D.值沒那麼準...但還是用它估算約15 ug 的DNA

去切酵素

想問大家大概都拿多少的DNA去做southern dig

2.探針

想問大家做探針的方法，畢竟植物genome複雜，都會擔心探針效率好不好

  a. 說明書是寫把insert接到T-vector裡面，再用酵素切，跑膠回收片段

拿去做探針。但切膠回收感覺都會流失很多...這方法我還沒試過

  b. PCR產物直接以Kit純化，之前都是用這方法做探針

探針效率以說明書的方法測試，也是ok的

  c. PCR產物跑膠之後，切膠回收片段，這方法我也沒試過..

這三種哪種方法比較好...?

3.目前實驗室有兩組Kit

DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
(Kit for color detection with NBT/BCIP)

DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
(Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use)

我知道是呈色方法不同，據廠商說是CSPD比較靈敏..

但我用CSPD也沒有成功過..

想問這兩組kit哪一組比較好，或是有做成功的人可分享一下經驗嗎?

我已經失敗到心灰意冷了> <

謝謝大家幫忙 及 耐心看完我的問題




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◆ From: 114.26.170.76
→ blence:拿到probe最好的方法當然是1,vector切下來要多少有多少
→ joycenino:那樓上都會照說明書寫的"模板DNA濃度1ug"去做探針嗎?