Re: [求救] Roche Southern DIG

[BGG (幹 不要查我 )]

※ 引述《joycenino (joycenino)》之銘言：
: 大家好:
:     想請教大家關於Southern DIG的實驗問題...
: 因為本實驗室尚無系統，我做了好幾次都只有marker跟positive control有雜合訊號..
: 我的材料是比較少人做的中草藥植物.."
: 用CTAB法抽取DNA
: 以下有幾個問題想請教大家..> <
: 1.植物gDNA的濃度 (這應該是最主要的問題..?)
:   我之前都是用O.D值測DNA的濃度，同時也會跑膠check
: 雖然我知道O.D.值沒那麼準...但還是用它估算約15 ug 的DNA
: 去切酵素
: 想問大家大概都拿多少的DNA去做southern dig

     15ug!! 要想想酵素切不切的動，以前都拿2~3ug，甚至1ug就夠了

: 2.探針
: 想問大家做探針的方法，畢竟植物genome複雜，都會擔心探針效率好不好
:   a. 說明書是寫把insert接到T-vector裡面，再用酵素切，跑膠回收片段
: 拿去做探針。但切膠回收感覺都會流失很多...這方法我還沒試過
:   b. PCR產物直接以Kit純化，之前都是用這方法做探針
: 探針效率以說明書的方法測試，也是ok的
:   c. PCR產物跑膠之後，切膠回收片段，這方法我也沒試過..
: 這三種哪種方法比較好...?

    以前都是用PCR clean kit 直接回收片段當probe
    要先跑膠確認size是否正確，通常 dig label 的片段會大一些，所以會準備
    一個不加 dig 當 control(這個PCR product 可以留下來當以後製備probe的材料)

: 3.目前實驗室有兩組Kit
: DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
: (Kit for color detection with NBT/BCIP)
: DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
: (Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use)
: 我知道是呈色方法不同，據廠商說是CSPD比較靈敏..
: 但我用CSPD也沒有成功過..
: 想問這兩組kit哪一組比較好，或是有做成功的人可分享一下經驗嗎?
: 我已經失敗到心灰意冷了> <
: 謝謝大家幫忙 及 耐心看完我的問題


    你有提到positive control有signal，可是你的樣品都沒有，可能是
    1) 樣品沒有你要的 insert，都用到15ug了，不至於看不到
    2) Probe label dig 有成功，但不是你要的probe

這是我能想到的，還有大大可以補充嗎?

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◆ From: 119.14.37.171
推 chougham:如果是轉殖植物可以考慮用抗生素的基因去合PROBE
推 joycenino:回樓上 我是轉殖植物 所以我用GUS PCR產物去做probe
→ joycenino:回原po.15ug的DNA是分開切的，最後再合成一管
→ joycenino:但礙於體積過大 load不進well中 我有用酒精沉澱去濃縮..
→ joycenino:關於你說的"不加DIG的當control"我沒有很懂耶..
→ joycenino:可以麻煩你再說一次嗎> < 謝謝!!
→ BGG:轉殖作物應該是很好做才對阿! 你有先篩過再做southern嗎?
→ BGG:DIG label PCR product size會比較大，所以才要做一個
→ BGG:不加DIG的PCR product當control，確定PCR size是對的
推 joycenino:我用pcr確認過那些都是轉殖株..原po的意思是拿PCR產物
→ joycenino:也一起拿跑膠轉漬(經稀釋的PCR產物)當control嗎
推 chougham:原PO的意思是~你如果用PCR合成PROBE的話~一個是用一般的
→ chougham:dNTP當CONTROL~一個用加DIG的~加DIG的是你要的PROBE
→ chougham:它會比用dNTP還要大一點
推 joycenino:那想問一下這樣做的用途是什麼?因為之前都沒這樣做過
→ joycenino:對這方法很陌生..謝謝你們解答
推 chougham:如果DIG-UTP有加進去~成功合成了PROBE你就知道啦
推 joycenino:所以是拿做好的探針(dig label)跟PCR產物跑膠check
→ joycenino:確認探針片段大小 及有沒有做成功囉?