推 hangzer:我不知道你的kit有沒有寫 不過我用的kit上有說不要用加熱 03/19 20:05
→ hangzer:法去酒精 但是我不知道為什麼就是了XD 03/19 20:06
→ a14743535:我是因為抽mini的時候可以放烘箱 03/19 20:23
→ a14743535:然後我想說最後面的步驟都一樣~那應該也可以放烘箱 03/19 20:24
→ a14743535:就把他放進去了 03/19 20:24
→ a14743535:可以請問h大是用那一家的嗎？ 03/19 20:33
推 kevin1983:烘箱應該是沒差 03/19 21:13
→ kevin1983:不過DNA binding和elute有等個幾分鐘再離心嗎? 03/19 21:15
→ blence:先別問有多少,其實我很想問你認為純化出來的濃度應該多少？ 03/19 21:16
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:17)
→ blence:顯然這件事kit很無辜,是你沒有仔細想過濃度應該會多少 03/19 21:18
→ a14743535:應該至少要有個10吧@@ 03/19 21:18
→ blence:好的像Q牌gel elution效率大概80%,若你只用20ul,怎麼有10？ 03/19 21:21
→ a14743535:回k大~我有等個幾分鐘才離心 03/19 21:21
→ a14743535:呃...我用比例去估算的 03/19 21:24
→ a14743535:load進去的總共是1ug DNA~recovery大概是60%的話 03/19 21:25
→ a14743535:用50uL回溶應該可得到600ng的DNA~ 03/19 21:26
→ a14743535:那20uL應該有個240ng左右吧@@ 03/19 21:26
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:26)
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:27)
→ a14743535:換算成濃度就10左右~@@ 03/19 21:27
補充一下~我有把兩個well的放在一起回溶過
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:36)
→ blence:暈倒.....你是切1ug plasmid,非1ug的900bp吧 03/19 22:11
→ a14743535:對 03/19 23:16
→ a14743535:1ug的plasmid切出來的insert不是也應該是1ug嗎?? 03/19 23:18
→ a90648:照你的算法光insert就有1ug，那就加上vector 2ug 03/19 23:24
→ a90648:這很有問題阿!! XD 03/19 23:24
→ a90648:請辜狗將bp換算成ug 03/19 23:26
→ xxtomnyxx:1ug plasmid 切下來的怎麼會有 1ug? 03/19 23:28
推 a90648:要粗略換算的V:I下去分1ug就可以了 03/19 23:29
→ xxtomnyxx:假設vector包含900的insert有4K，1ug plasmid 拿去切， 03/19 23:29
→ a14743535:哈哈哈~~我忽然發現我的這個數學有點白痴~~XD 03/19 23:30
→ xxtomnyxx:900 bp 的片段只有會 1ug×(900/4000)= 225 ng 而已啊。 03/19 23:30
推 joseph103331:所以你有沒有做接下來的實驗啊? 03/19 23:35
→ joseph103331:這種濃度常常都很低 因為用kit抽 我就直接ligation了 03/19 23:36
→ joseph103331:如果vector也有切過膠的話 有長有中 03/19 23:37
→ a14743535:沒有耶~因為A260/280的值也很有問題 03/19 23:39
→ a14743535:所以我就沒用@@ 03/19 23:39
→ xxtomnyxx:通常 GelEx 的 260/280 本來就會很難看，畢竟濃度很低。 03/19 23:41
→ xxtomnyxx:一般來說用跑膠確認比較好，只要有 band 我都會不管 03/19 23:41
→ xxtomnyxx:260/280 直接繼續往下做。 03/19 23:41
推 joseph103331:推跑膠確認 不過我通常會切個5ug以提高機率XD 03/19 23:43
→ joseph103331:反正用的enzyme濃度還是一樣嘛.... 03/19 23:44
→ blence:不需跑膠確認,也不需提高濃度,更不須測濃度,算數推估即可 03/19 23:58
→ blence:前面三種除了讓你更費工更憂慮失敗以外,沒有實質幫助 03/20 00:00
推 conective:應該是要提高一開始切的量吧 03/20 08:23
推 iceking:1. gel extraction的膠,越小越好~ 以提高濃度 03/20 09:30
→ iceking:2 建議一定要跑膠確認~ 比A260/280 有參考價值~ 03/20 09:30
推 iceking: 3. 依經驗這濃度繼續跑下去也是能成功~ 03/20 09:35
→ a14743535:感謝大家的指點~我會下更多量的plasmid去切的 03/20 13:40
→ blence:慘,ligation不需要太多insert,現有的濃度跟總量已經夠用了 03/20 13:51
→ blence:增加plasmid用量只是為跑膠看到,也不會因此用在ligation上 03/20 13:53
→ blence:結果還得付出切多量導致切不乾淨,效率不佳,純化不便等問題 03/20 13:55
→ blence:至於gel elute後跑膠的問題更不用說,幾篇板上文章反應elute 03/20 13:58
→ blence:之後跑膠看到size變高或變低導致實驗不敢進行,更是跑膠缺點 03/20 13:59
推 joseph103331:都要切膠純化了 本來的plasmid切不乾淨其實無妨吧 03/21 14:59
→ joseph103331:實際上的確也是不用切這麼多 但能提升ligation的機會 03/21 15:00
→ joseph103331:像這種搬家的實驗切完膠以後通常可以直接往下做 03/21 15:00
推 huuban:其實濃度低的狀況你可以取2ul跑膠看東西在不在.. 03/22 00:15
→ huuban:如果東西在，跟ladder比亮度算濃度，還是可以接進vector的 03/22 00:15
→ iceking:對阿! 與其取2ul來測260/280,不如拿來跑膠.跑膠也可知濃度 03/22 09:37
→ blence:跑膠,以原po的例子2ul怎麼看得到,一直強調跑膠前請想一下 03/22 12:25
→ blence:一般用的EtBr靈敏度極限,再想想2ul看不看得到,若是3~500bp 03/22 12:27
→ blence:同樣切1ug,連5~10ul也可能看不到,結果就是elute全拿來跑膠 03/22 12:29
→ blence:前一個說跟ladder比亮度的就更扯了,ladder大概都25~50ng 03/22 12:33
→ blence:如果原po也這樣比較,大概可ligate的,會以為elute失敗而丟掉 03/22 12:37
推 iceking:婀~ 跑膠的靈敏度是ng 原po的例子已經足以看到~ 03/22 12:59
→ blence:EtBr大概5~10ng,內染又更慘,或是你覺得原po是用高級染劑 03/22 13:04
推 iceking:5~10ng 所以原po的2ul足以看到~ 沒錯阿! 03/22 13:16
→ blence:原po的濃度都低於5,取2ul是要挑戰機器的靈敏度 03/22 13:26
→ blence:而且今天做的是300~500或200bp的miRNA,那2ul跑膠不就更慘 03/22 13:28
→ blence:跑膠可以確認,但不少人都把可往下做的東西,膠沒看到就丟了 03/22 13:32
→ blence:這類文板上也不少,都是小片段跑膠看不到就歸罪kit純化失敗 03/22 13:34
推 iceking:事實上依經驗,EtBr可以看到更少的量,2~3ng都還可以~ 03/22 13:54
→ iceking:做ligation,你勢必要知道insert的量,方法不外乎就是 03/22 13:55
→ iceking:1.測OD 2.跑膠 這兩種方法所需的體積幾乎是一樣的 03/22 13:55
→ iceking:大約都是1~2ul就可以~ 因此沒有所謂全拿來跑膠的問題~ 03/22 13:56
→ iceking:而跑膠可以獲得的資訊,比純測OD要多~ 03/22 13:58
→ huuban:其實測nanodrop濃度不到10，也可能一跑膠就看得到band喔 03/22 13:58
→ huuban:簡單的說取2ul跑膠看不到那你應該很難接上，就這麼回事 03/22 13:58
→ iceking:你可以知道size,可以知道大概的量~ ligation只要知道大約 03/22 13:58
→ iceking:即可~ 我的經驗也跟hunban大一樣~ 03/22 13:59
→ blence:以我最近做的200+3k, 切1ug,照原po的條件,濃度只有1.5ng/ul 03/22 14:02
→ blence:但就算是200+7k的pLKO,濃度連1ng都不到,ligation也很好做 03/22 14:04
→ blence:小片段濃度很低本來就很正常,沒有濃度低就接不起來這回事 03/22 14:05
→ blence:像ligation時200bp拿1ng,2kb就要20ng,就molar比ng更重要 03/22 14:09
→ blence:以跑膠或測OD眼睛想看到ng來評估ligation成功是很不恰當的 03/22 14:12
→ blence:因為小片段看不到不代表失敗,反之大片段看得到卻代表會失敗 03/22 14:14
→ blence:iceking講出重點了,知道size計算最重要,測OD跟跑膠都可省略 03/22 14:17
推 tsubasawolfy:跑膠只是求心安 O/N時比較睡的著XDD 03/22 14:17
→ tsubasawolfy:濃度大小自己算一算就知道跑膠到底看不看的到 03/22 14:18
→ tsubasawolfy:測OD部分反而比較要注重dna品質(260/280 260/230) 03/22 14:19
→ iceking:可省略一樣做得出是沒錯,但這是偷吃步,實驗還是要拿得出 03/22 15:25
→ iceking:證據~ 我講的是比較規矩的做法罷了. 260/280在此時其實 03/22 15:26
→ iceking:比較不具參考價值了,因為錯誤率太大~ 03/22 15:27
→ iceking:我知道後面成功,就代表過程沒問題了,只是過程的確認在科學 03/22 15:29
→ iceking:裡面也是很重要的~ 03/22 15:29
推 tsubasawolfy:看後面ligation是哪一種吧?sticky跟TA哪種就不要求 03/22 15:31
→ tsubasawolfy:blunt end就龜毛了.... 03/22 15:32
推 joseph103331:知道哪裡可以省略也是一種know-how阿~ 03/23 19:28
推 joseph103331:要用到跑膠等等方式都是用來trouble shooting的 03/23 19:30
→ chaunen:如果沒有, 你後面transform到天荒地老也不會有clone的. 04/17 13:44