[求救] PCR無法放大片段

[adamada (soso)]

 手上有一對primer

 如果是用Plasmid當template的話

 這對primer是可以使用

 但如果把plasmid放大的產物經由Gel-extract後

 拿來再次放大

 卻無法有產物!!!而只有Smear.....

 請問有什麼方法可以解決嗎??

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 134.76.0.211
推 qiet:template放多少啊...會不會濃度過高
→ xxtomnyxx:GelEx 是否有超過一條的 band?  PCR 的詳細條件？
→ xxtomnyxx:還有你用什麼溶液來回溶 GelEx 的 DNA？
→ BGG:濃度太高是會p不出來的，大概5-10ng 就行了
→ adamada:X我是用水回溶的！至於pcr條件沒有變，只有template不同！
→ adamada:產物只有single band!其實其他對primer都沒問題！
→ adamada:我放50ng!!我會向下修！但我plasmid用200ng也有阿！Orz
推 qiet:都太高了吧...plasmid用<1ng都沒問題, 用PCR product當
→ qiet:template得要更低,
→ JanChang:用nested-PCR試試看，有時PCR產物本身兩端primer黏合的部
→ JanChang:份會放大不完全，用它們當templates可能就會產生smear不
→ JanChang:盡理想的結果。
推 supray:純化過的plasmid   10~100pg就夠了
推 yawai:P過的產物最好不要用原來的primer重新P喔 最好用nested-PCR
→ yawai:這樣polymerase在template上才有立足點