[討論] luciferase assay相關問題

[xilo129 (游水的魚)]

麻煩大家
解決我面臨到的問題(如果做出來，我就可以順利畢業了>"<)
以下是我的問題:
我找到兩個miRNA，然後用線上預測網站去預測他的TARGET GENE
找到之後，在細胞內大量表現我的miRNA
用WESTERN BLOT 看到我要看的PROTEIN 表現量有下降(先偷看有沒有作用)
之後就要用LUCIFERASE ASSAY去證明，我的miRNA會不會直接跟我的TARGET GENE BINDING
但是我的Luciferase 沒有被壓下來或是有時候有壓下來。我調過target gene與miRNA之間的比例(1:1,1:3,1:4)
也看過Transfection 24hr,48hr
這樣的結果是在說明，我的miRNA跟我的TARGET GENE沒有直接Binding的關係嗎???
這樣子，我又要如何走我的下一步呢????
麻煩你們給我一點方向

以下是我transfection 的condition

transfection reagent:lipofetamine LTX
Seeding in 24 well plate

每個well的plasmid量

A
miRNA construct           250ng
target gene construct     250ng
renilla                   13ng
opti-mem                  50ul

B
lipo                       2ul
opti-mem                   50ul

A+B MIX
在加入WELL中並補400ul medium
過3hr換medium
放24hr

麻煩各位了(鞠躬~~)



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.121.119
推 HEK293:有沒有直接binding，我想還是需要個control (mutant)
→ HEK293:transfection看起來問題應該不大，先確定target的UTR序列
→ HEK293:然後miRNA是否真的over-expressed。
→ HEK293:construction是自製還是commercialized product？
→ HEK293:必要時可以考慮RIP跑Ago2看看
→ xilo129:都是自製construct的
→ xilo129:RIP跑Ago2是???
推 HEK293:有直接看binding的方法是cotransfect AGO2跟target UTR後IP
→ HEK293:AGO2下來跑qPCR來看。類似ChIP的作法。
→ HEK293:另外reporter的作法需要mutant form做nega. cont.比較好
→ xxtomnyxx:你找到的miRNA targeting 的gene序列是在 5'-UTR 上嗎？
→ xxtomnyxx:一般來說 Luc Assay 檢測的是 gene promoter 的活性，
→ xxtomnyxx:如果 miRNA 作用的序列是在 CDS 上，是不能用 Luc Assay
→ xxtomnyxx:去看的吧？
推 aceliang:一般通常是3'UTR，luc assay可以把該基因的UTR放fluc的3'
→ aceliang:市面上也有這類型的reporter system。pMIR-report系列等
推 TAKONA:mutant要一起做+1
→ TAKONA:另外推薦psiCHECK-2，有IRES-drived internal control
→ TAKONA:方便又好用
→ TAKONA:但這也是用3'-UTR
推 joseph103331:你有每次都確認miRNA有作用嗎? 如果沒有的話....