[求救] 抽RNA和Q-PCR相關問題

[pent (愛、失敗、死亡)]

有些問題想請教，抽RNA的最後一步是用75% DEPC-H2O 配的75%酒精
之後，倒扣讓它乾，這時候大家會放多久呢?
實驗室的學姐說，她不敢讓它放超過20分鐘，不然太乾會很難溶，

但是我的狀況是
，最後eppendorf裡都會剩一滴水珠的部分，
這水珠到底是酒精??還是只剩下水???

因為這次，我十多個sample，細胞數約5*10^6抽RNA，
結果就一管，我看它裡面有水珠，特地拿10ul pipet吸，
結果它的濃度最低，只有50ng/ul，其他至少都200ng/ul，
有人有遇過嗎?

另外q-pcr，一定要差1.5倍 or 2~3倍以上才是真的有差異嗎?
我是primary culture的細胞，要比較有hypoxia跟沒有，target gene表現有沒有變化

還有我用Sybr green跑的時候，GAPDH,target gene, NTC 共40 cycles,
no-template control(NTC)都沒signal，


但是用TaqMan，大概在36-37cycles NTC都會友signal，這是正常嗎?

謝謝回答

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◆ From: 140.109.40.72
推 leoblack:你學姐說的沒錯~真的不要放太乾~會很難溶
推 qqaz:我自己抽RNA是放在laminar flow抽風到乾(RNA pellet白色變無
→ qqaz:色，轉cDNA再跑real-timePCR 大約5~10cycle便有訊號
→ qqaz:若是你細胞太少，細胞size較大，那麼你就要一次收大量的細胞
→ qqaz:Sybr green，GAPDH跑到40 cycles含量已經太稀少
→ qqaz:real-time PCR 每差1個cycle都是2^1.7，你若做二重複，同樣品
→ qqaz:都有可能因為些微的誤差而有差異1~2cycle，故你的實驗組差異
→ qqaz:不可以過小，不然無法知道是誤差還是差異
sorry, 我有些地方打錯，是我總共跑40cycles，不是GAPDH跑到40才有訓號
但如果我做三次，不是指三重複，是整個實驗，養細胞，hypoxia...，repeat三次，
然後三次Q-PCR 分析Ct值後，差異倍數變化從1.1-2.2 或從1.4-1.7倍的差異
這樣要算是有變化還是沒變化???
會有人argue說，這才1.x多倍的增加，一定不是真的  嗎??
※ 編輯: pent            來自: 140.109.40.72        (04/03 23:01)
推 qiet:有沒有差不是用感覺吧, 看統計是否有顯著差異啊
→ qiet:另外也要搭配上蛋白質的表現才足夠證明有差
推 chaunen:放乾一點沒差, 加DEPC水後 58度C加熱15 mins即可
推 mesenchymal:放乾前先用suction或離心把大部分液體移除
→ mesenchymal:三重複後統計算看看就知道有沒有顯著差異了
推 ararthur:放乾點沒差 RNA少量不會不好溶 不過倒扣...乾不大了吧
→ ararthur:我習慣用75%wash完再用100%wash 倒乾 spin 吸乾 37度或
→ ararthur:laminar flow五分鐘 就會全乾了 量少可能是透明或半透明
→ ararthur:量真的很多 則會呈現白色塊狀
→ ararthur:數據部分 統計有差就有差 統計沒顯著就沒差 千萬別主觀