Re: [求救] High Range DNA Ladder

[licat (licat)]

我想你的目的應該是, 要確認這個接好的15 kb質體是不是正確地被構築

如果是這樣, 其實你應該先確認你的質體上限制脢的切位

選擇適合的數種限制脢組合來切割你的質體後, 再跑電泳確認是否如預期大小

例如本來15 kb大小的質體預期被...

BamHI切割後, 會變成 1 kb + 8kb + 6 kb
SalI切割後, 會變成  3 kb + 5 kb + 7 kb
XbaI切割後, 會變成  5kb + 8 kb + 2 kb
XhoI+EcoRV切割後, 會變成 2 kb + 3 kb +10 kb


等等, 然後分別進行酵素反應後, 再跑電泳確認是否如你的預期, 以這種方式來確認

所以你最好先知道你接到pBR322的各個片段中, 有甚麼酵素切位

如果有某個片段是你不知道序列, 所以無法預測酵素切位的, 也沒關係

至少你一定知道pBR322, DsRed...這些的序列, 就可以用以選擇該使用那些酵素了

因此其實你不需要買那個大片段的marker, 因為你們似乎沒有適合的電泳設備

然後分析大片段又比較麻煩跟不準確

而且環狀跟線狀DNA電泳速率不同, 是沒有辦法互相比較的

(質體一定要經過限制脢切割後才能與線狀DNA marker比較)

這是我的建議, 歡迎討論 :)


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 36.229.210.193
推 fvf:所以一次使用2種以上的酵素做切割是可行的嗎?
→ fvf:我建構之後的replicon質體是已經有做過定序的
→ fvf:只是還想要更貪心一點，做出全長clone
→ fvf:只是初步做的時候會因為片段大小增加不明顯
→ fvf:所以想試試看這種大範圍的DNA marker
→ fvf:感謝您的想法，等連假結束後我可以試試看，非常感謝您!
→ licat:一次切割兩種以上酵素是可行的 只是要注意buffer相容性
→ licat:不大確定你的定序方式是?
→ licat:一般的定序方式只能確認大概1 kb片段吧
→ licat:而且無法確認你接進去的方向性是否正確 等等問題
推 fvf:以酵素切割做初步大小的確認，再以多組引子送生技公司定序
→ fvf:每個片段都是以兩種不同酵素切位做專一性連接
→ licat:了解~
→ blence:推這一篇,而且文章內已經提到不需用兩種酵素切,你應該找一
→ blence:個酵素具有多點切位的作用當作fingerprinting方式確認size
→ BGG:單一enzyme有多個切位也行，主要是讓你容易在跑電泳的時候分析
推 leoblack:看到這樣的發問~我好奇你知道DNA marker是用來標定linear
→ leoblack:DNA的嘛?!也就是15K DNA不切成linear會跟marker對不起來