[求救] western 結果毛毛的 訊號不強

[worldsky (不知要用啥???)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----



大家好

小弟最近在做western的實驗，遇到了鬼打牆的瓶頸...T_T

我的protein在經過X光壓片後，會出現如以下圖的狀況...


圖片連結：http://ppt.cc/gZaF (X光片壓片時間1分鐘)


我的protein們會毛毛的 但是隱隱約約還可以看見其中的band...

感覺就是protein有點散開 有出現光暈的那種FU

而且相同的protein以前壓的時候大概30秒訊號就很夠了 而且很集中

但是現在要壓到3分鐘訊號還沒有那麼強 而且散開 又糊糊的

但是PVDF上面的marker卻是很sharp，沒有糊掉的狀況

想請問各位版上的大人們

是否可以給小弟一點建議

指點一下迷津

因為困擾了很久 想說來向各位前輩們求教了 感激不盡


以下為我的western 條件

protein loading 量: 30

protein loading 體積: 20-30 uL

開始跑膠前，會先pre-run: 80V 10min

Running條件: 60V upper gel, 80V lower gel, 總共時間~150min，室溫
↓
Transfer條件: 300 mA, 2 hour, 0.45孔徑的PVDF, 埋在冰塊裡面轉漬
↓
Blocking: 5% BSA or 5% skim mlik, 室溫1小時
↓
Wash: TBST with 0.1% tween-20, 5次, 每次5分
↓
1st Ab: 稀釋倍數如廠商建議量，4度C, overnight
↓
Wash
↓
2nd Ab: 稀釋倍數10,000-20,000x，確認二抗沒有用錯
↓
Wash
↓
壓片：片子在投影片上擺好，ECL先混好再淋上去，擦乾多餘的ECL，蓋上投影片壓片
      (洗片為自動洗片機，自動洗片機確認沒有問題，因為其他實驗室同學都OK)


有勞各位前輩了

真的是萬分感激

小弟在這邊先向各位致上最高的的謝意

感激不盡!!!!!!!


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.96.75
推 g1409:有換過ECL嗎? 我之前遇過換了ECL 同樣方法做出來就是燒BAND
推 alaric:sample buffer.
→ worldsky:想問alaric大，是指sample buffer可能有問題嗎? 謝謝!!!
推 icome:應該只是訊號太強吧  一分鐘就這麼一大坨
→ blence:因為你用壓片,我會猜用到雙面感光片,或少了白色enhancer
推 keeny:我覺得WB沒問題,訊號也強,會不會是film不好,拿別人的試試