[求救] Transformation 超級怪囧

[lucky1300 (會死人的高跟鞋)]

前情提要：

目前手上正在接一個 vector 9.6K/insert 1.5K 的construct

vector使用割膠回收取得
inster使用PCR取得

以molar ratio I:V=3:1 的量
使用T4 ligase室溫作用3小時後轉到JM109
heat shock後塗抹在LB+Amp的固體培養基

o/n之後 培養基上有長出菌落 （我有作vector only的培養基 沒有長）
挑將近10個菌落作colony PCR（同時也有另外塗一盤保留，以下稱plate-B）
primer一條使用vector上的 一條使用insert上的
跑膠後在正確的位置上有出現明顯條帶

-----問題開始---------------------------------------------------

為了再次確認是否得到正確construct
我挑了Plate-B上的菌落 用liquid LB+Amp養小量
想抽plasmid 再用限制酵素去切確認片段大小

奇怪的是 我Plate-B上的菌落丟到liquid LB+Amp 12個小時之後什麼都沒長
再挑幾個菌落去作也是一樣什麼都沒長出來
我確定我液態跟固態培養基所使用的Amp濃度是一樣的
（而我同時也有進行另一個construct 使用同一罐液態培養基結果很正常）




因此還煩請版上有經驗的朋友多多給我意見
我還不想放棄這次的結果Q_Q



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                                        禮貌歐  ▼             ┴─┴      

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.168.64.47
→ blence:同時塗兩盤,為什麼會覺得plate-B是雜菌...
請問同時塗兩盤的意思是？雖然我也不覺得plate-B是雜菌XD

→ sylvialalala:我的clony pcr第一次check很多都有false-positive的
→ sylvialalala:band..我建議你可以重用第一次p出來的primer再
→ sylvialalala:p plate-b的菌落,這樣就知道plate-b上的還是不是你要
如果是false-positive band的話 養菌是不是應該還是可以長得起來？
但後續用酵素確認會切不到正確的大小這樣

另外也非常非常感謝您的建議 我明天再試試看！

※ 編輯: lucky1300       來自: 118.168.64.47        (04/24 22:21)
推 TOTO:V:I=3:1? 正常不是應該是1:3
嗯嗯是的 感謝提醒一時打太快沒注意！
※ 編輯: lucky1300       來自: 118.168.64.47        (04/24 22:27)
→ blence:原po不是說塗一盤挑c-PCR,另一盤為plate-B,不是同時塗兩盤?
→ blence:有些不見得是原因,不過你這case不該用JM109,對plasmid>6k容
→ blence:易不好,許多操作手冊會寫,另外大plasmid或有recombination
→ blence:用c-PCR想必容易false
我作的順序是用tip從原始那盤挑一個菌 在另外一盤（plate-B）劃一道
再來就直接在加好PCR藥劑的tube裡攪一攪這樣 不好意思沒有講清楚

我之前有接過幾個大於10K的plasmid 因為JM109用得順手所以就一直使用也沒去看手冊囧
非常非常感謝B大的提醒 ：）


※ 編輯: lucky1300       來自: 118.168.64.47        (04/24 22:36)
→ blence:再確認此cloning問題是源自vector,還是該insert在其他Vecto
→ blence:也會,如果是後者,就不適合用該vector慣用方式處理
→ blence:我有幾個大contruct送進Ecoil長的起來,但只要把plate或mini
→ blence:冰箱,要嘛長不好(6h看到有濁,12h卻澄清死光光),也常空包彈

從大家過去的經驗我猜應該是vector的影響比較大
那我會再去看看原始的vector是被轉到哪個菌裡
非常感謝您的熱心！
※ 編輯: lucky1300       來自: 118.168.64.47        (04/24 22:44)
※ 編輯: lucky1300       來自: 118.168.64.47        (04/24 22:45)
→ storm780121:PCR有擺negative control嗎?
→ pianostar:這麼大的plasmid 用電的也許成功率會高很多吧?
→ pianostar:菌養不出來 可以養個抗amp的ecoli 做control 排除器材