[求救] glycerol stock 若是被雜菌污染

[allthebest (allthebest)]

事由:plasmid transfection細胞後一直污染

做法:stock 種midi 然後抽plasmid
plasmid+jetpei+transfers buffer 做transfection(24hr觀察就有長菌了)
已重抽兩遍....做transform都有污染...

已做的truble shooting:
1.2.3.buffer,plasmid,jetpei only
4.plasmid+buffer+jetpei
結果1，2，3乾淨4又長菌了(我要崩潰了)到底為什麼啦？(爆氣

尤其是我一次抽很多不同midi 只有這一隻plasmid怪怪的  總之我決定重新transform
不過先假設是我眼殘(沒在plasmid only看到有菌)真的是plasmid有污染好了 我很好奇如果在stock有雜菌在抽完plasmid後也會有菌菌污染嗎？(我很確定elution buffer是乾淨的)但就算stock有雜菌我最後不是也只會得到雜菌的plasmid嗎？？？






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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 101.9.217.244
→ xxtomnyxx:你有試過把plasmid在hood中做酒精沉澱重新回溶嗎？
→ allthebest:沒有耶  不過我用的midi prep kit的wash buffer倒是有
→ allthebest:所以x大的意思是 抽完並elute出來的plasmid要再做一次
→ xxtomnyxx:如果你已經抽出plasmid，卻懷疑他可能有汙染，可以再做
→ xxtomnyxx:一次酒精沉澱把汙染物去掉。
→ xxtomnyxx:基本上凍菌就算有汙染，也只會讓你種LB時就長雜菌或發霉
→ xxtomnyxx:，或是抽出莫名其妙的plasmid，不會把汙染物帶到elute中
→ xxtomnyxx:，因為抽plasmid的buffer 2 基本上會殺光細菌黴菌。
→ xxtomnyxx:你有試過排除其他可能汙染源嗎？例如把medium拿去incub-
→ xxtomnyxx:ator 放個1、2天？
→ roy047:同意樓上~不然每次transfection都會有E.coli汙染(也是菌啊)
→ roy047:測: plasmid only, jetPEI only, serum free medium only
→ roy047:serum free medium是transfection時使用的那個
→ roy047:orz 有點搞錯 jetPEI是用NaCl, 不是用medium 就測NaCl看看
→ roy047:然後可以測久一點 有時因時間太短不明顯所以會誤判沒汙染
推 kevin1983:buffer2含SDS不就破菌了嗎？stock有污染也不會到plasmid
→ allthebest:我也知道問題有點蠢 因為發文後半段也有寫頂多只抽出
→ allthebest:雜菌的plasmid
→ allthebest:我也有空培 back only,plasmid only
推 HEK293:雜菌的plasmid是三小？
→ allthebest:nacl only (打錯
→ allthebest:請連著看 ="=
推 silentence:怕抽到雜菌的拿去enzyme digestion跑膠看看阿