[求救] 實驗新手求問序列正反接問題

[LintongBis (Bis)]

今天被老師問了一個問題
如果我今天做了blunt end的cloning,
要怎麼知道insert是正接還是反接?

我想到的是(1)拿去送定序,再alignment比對
可是定序只要定預計插進去的CDS區就好嗎?還是全部insert(primer全長)都要比對?

(2)拿去切酵素,切完酵素之後跑膠看insert掉下來的位置?

(3)定序定整個cloning(感覺不可行..)


懇請高手賜教謝謝

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◆ From: 210.60.122.200
→ a90648:你可以先了解一下，正接和反接哪邊會不一樣
應該只有序列不同嗎?(猜測..)
→ storm780121:forward plasmid primer + reverse insert primer
意思是我可以將cloning抽出來後以forward plasmid primer + reverse insert primer
定序確認嗎?
推 joseph103331:定序好啊 有錢的話... blunt end酵素不見得能切
推 nike77114:insert上面選個切位，plasmid上面選個切位先確認
可是可以被酵素切斷不就只是證明我有clone成功,
還是不知道他是正接反接?
※ 編輯: LintongBis      來自: 175.181.110.202      (05/09 23:06)
推 tiffan1118:可是你可以知道長度 就可以判斷 選unique的
→ storm780121:我好像沒說清楚 用plasmid上 頭的primer當forward +
→ storm780121:insert內用尾巴的primer當reverse
→ storm780121:可以p出來就是對的colony p不出來就是接反or雜菌
→ storm780121:P出來的大小也要稍微看一下 negative control也要擺