[求救] western 壓片雜點

[qqmango (聽，是誰在唱歌)]

  最近在壓Plasma membrane上的蛋白質，利用不同NP-40濃度的分離protocol。

  但跑完照UVP後，發現在目標蛋白質大小的部份(48-63kd)，會有莫名其妙的雜點。

  如圖: https://www.dropbox.com/s/me5f16hp1r2mqif/sdf.jpg

  而internal control的部份(9x kd 以上)背景則是相當乾淨。


  當初懷疑可能是一抗或是blocking suloution(5% milk powder)的關係，

  但昨天用了一般WB的萃取total protein去壓目標蛋白質，卻沒有這樣的問題。


  懷疑會是在分離膜蛋白質時用了NP-40的關係(0.1% -> Free -> 1%)，

  實驗室的NP-40放在離心管應該有個一兩年以上了，不確定會不會是這個因素，

  但在Internal control的部份90kd以上，又不會有這些雜訊。

  不知道有沒有哪位前輩可以救命，感謝!

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 所有物理定律都不是百分之百正確，
     當然，更不是真理。
             物理定律只是反映出，人類企圖定量的暸解物質宇宙過程中，
        所給出的數學模型。                     就像牛頓運動定律是不正確，
            牛頓萬有引力定律也不太正確，                       < 聯立 >
          但這並無損它們在人類探索自然定律過程中的地位，它們具有永恆的價值。

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◆ From: 140.112.98.191
※ 編輯: qqmango         來自: 140.112.98.191       (05/11 15:23)
※ 編輯: qqmango         來自: 140.112.98.191       (05/11 15:23)
→ blence:很像一抗的問題,放太久,有沉澱,未spin等,尤其是放冷藏的
→ lask:有些一抗你泡在牛奶裡會這樣，可以改成泡在 1% BSA中試試
→ lask:同一片SAMPLE其他蛋白都沒問題，我不會先去懷疑蛋白有問題
→ qqmango:一抗是在5% BSA中壓o/n，因為一般抽的話壓起來都ok，但用
→ qqmango:膜蛋白分離protocol才會出現，所以不知道是什麼狀況
→ jsi:牛奶沒有完全溶解也會造成這種現象
→ qqmango:因為同一片都是用同樣的blocking sol.，有可能會因為抗體
→ qqmango:的關係而有差異嗎?
→ qqmango:但是若是壓Whole cell lysate又很正常，可能會是什麼因素
→ qqmango:呢?