[求救] WB的band不平

[lxz (夢與天空交織的瞬間)]

請教各位板友前輩

我最近在做Co-IP，先用100ul的protein A sepharose beads與1ug的抗體做conjugation

之後再去抓protein，之後用等體積的2x sample buffer配成sample

但是跑完WB的時候去照膠發現band都不水平...

我有把體積調成等量了

sample煮完之後也利用離心把beads盡量去除了
(我會把sample先離心，把液體吸至新的tube在離心一次，然後只有取40ul*2次出來load
gel，且都從液面開始吸)

但為什麼我WB的band都會歪歪斜斜的不在同一條水平線上呢>"<

是不是跟transfer也有關係呢?

我把gel放到membrane(NC)上時會用滾輪趕泡泡，這樣會造成影響嗎?

我們是用Bio-Rad的transfer machine ( http://ppt.cc/IGQ9 )

由於要看的蛋白很大，Transfer時間較長，有時候gel會燒焦，這也會影響嗎@@?

謝謝大家~煩請解惑<(_"_)>

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.250.122.24
→ xxtomnyxx:Western blot 的結果圖呢？有圖片比較好判斷問題點。
→ xxtomnyxx:不過你說的歪歪斜斜，是每一條 band 個別都歪歪斜斜，
→ xxtomnyxx:還是所有的 band 連成一條斜線或有弧度的線？
圖要等我下班才方便放上來，我晚點放，謝謝您^^
Sorry~昨天太忙，今天附上圖片 http://ppt.cc/6Bd- 謝謝~

→ blence:假設你用這台,用他整套transfer耗材,那張gel很容易變形就會
→ blence:歪斜,可是你說會燒焦,推測你用自家耗材,你的蛋白應該過的不
→ blence:完全,當然,會變形也跟為了跑大蛋白才用低％的gel有關
→ blence:不過你應該也會在WCE看到不平整現象,不只是IP-martics
後來想想應該不是這個問題，因為跑一般WB不會這樣，還是謝謝您^^
※ 編輯: lxz             來自: 111.250.122.24       (05/29 08:21)
※ 編輯: lxz             來自: 111.250.101.97       (05/30 23:36)
→ blence:看起來是％相關阿,而且每個well的PSB濃度不一樣加重了
這麼嚴重的歪斜確實只出現在低%的Gel，在sample buffer的部分也不一樣
input(左)及PC(右)都是加5x sample buffer去配，但beads pellet是用2xSB，且來源不同
跟同學討論的結果可能是鹽類濃度不一造成
※ 編輯: lxz             來自: 111.250.101.97       (05/31 08:20)