※ 引述《lxz (夢與天空交織的瞬間)》之銘言：
: 請教各位板友前輩
: 我最近在做Co-IP，先用100ul的protein A sepharose beads與1ug的抗體做conjugation
: 之後再去抓protein，之後用等體積的2x sample buffer配成sample
: 但是跑完WB的時候去照膠發現band都不水平...
: 我有把體積調成等量了
: sample煮完之後也利用離心把beads盡量去除了
: (我會把sample先離心，把液體吸至新的tube在離心一次，然後只有取40ul*2次出來load
: gel，且都從液面開始吸)
: 但為什麼我WB的band都會歪歪斜斜的不在同一條水平線上呢>"<
: 是不是跟transfer也有關係呢?
: 我把gel放到membrane(NC)上時會用滾輪趕泡泡，這樣會造成影響嗎?
: 我們是用Bio-Rad的transfer machine ( http://ppt.cc/IGQ9 )
: 由於要看的蛋白很大，Transfer時間較長，有時候gel會燒焦，這也會影響嗎@@?
: 謝謝大家~煩請解惑<(_"_)>
CoIP, 2X sample buffer 我猜你loading的量應該很大吧
以前是有遇過Stacking gel太短 Sample太多 跑出來的Band就會很肥
因為後面的來不及跟前面的壓成一條線 前面的protein就往前跑了
所以你用高%的Resolving GEL不會看到 就可能是因為前面的跑得比較慢
可以等後面的protein一起往下跑
如果真的是因為Stacking gel太短
你的band歪斜的形狀 可能跟你Well底部氣泡造成的破裂形狀很像
Stacking gel太短是人之常情 用到低%的gel就是想要讓Band分開一點
是很常見的失誤 :)
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