[求救] IP總是出現non-specific band

[cdkcyclin (ilovesuju)]

各位板友好，

我的實驗是想透過IP研究蛋白質A和N在腦瘤細胞中是否有直接的interaction。
我將V5-A和Flag-N的plasmid，同時transfect到細胞中，之後就可以利用V5或是Flag抗體
來pull down (control組用mIgG)。跑完WB之後，用V5與Flag抗體來偵測所抓下來的蛋白
質。

可是我現在遇到一個問題了。在我的IgG組，總是會偵測到一個non-specific band， 而
且這個band的位置，正好與Flag-N的大小幾乎一樣(大約110kD)。

為什麼我會知道那是non-specific band，而不是Flag-N。因為我之前做了一個簡單的測
試，我只transfect V5-A (沒有Flag-N)，然後用IgG與V5抗體去pull down。之後我將跑
完的膠，還是用Flag抗體來hybridize，結果在同樣的位置也出現這條band。

我附上我做的測試實驗，這樣子應該會更清楚。
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=hahaha93&b=1&f=1050765560&p=0

希望如果有對IP很有經驗的版友們，可以給我一些建議，
或是有人願意跟我討論實驗就太好了，多謝大家了。


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 141.50.39.150
推 leoblack:不能換別種species的Ab再做一次IP嘛?!
→ blence:我會想把WB的Flag換一下,因為看起來不是IP的問題
推 joseph103331:這是二抗的問題 會認到IP用的抗體
→ joseph103331:理想上IP的抗體用的物種跟WB用的不一樣最乾淨
→ joseph103331:換tag一樣要避開物種 不然有極大可能會有一樣的問題
→ blence:如果是二抗問題,mouse二抗並沒有認到mFlag喔,除非曝光不夠
→ blence:我說的換Flag當然是換別物種或換支Ab clone,而非換其他tag
→ cdkcyclin:謝謝各位,所以我如果用別物種的anti-flag Ab for WB
→ cdkcyclin:應該可以避免二抗結合到IP用的抗體上囉
→ cdkcyclin:blence大說的也很有道理，但在我別次的IP實驗中，
→ cdkcyclin:當我用Flag Ab IP時,比較沒有這個問題,但IgG組一直都有
→ cdkcyclin:non-specific band的產生
推 joseph103331:不同支抗體可能會有不一樣的band出來 很難講呢
→ joseph103331:換WB的抗體問題應該可以解決