Re: [求救] 釣出全長序列，未知基因

[EDONIS (ED)]

請問，老師說我必須抽 genomic DNA做Southern blot,
將promoter, introns片段clone出來, 序列讀出來,
怎麼辦!!我完全不懂Southern blot找全長??
跪求ORZ!!
※ 引述《puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)》之銘言：
: ※ 引述《EDONIS (ED)》之銘言：
: : 請問由於用cDNA library的方法 CLONE到一段序列
: : 是片段序列，老師希望我能把這序列的全長拿到!!
: : 在去比對看是甚麼。請問這能RACE的方法來做嗎??
: : 還是??
: 假設你找到的東西在Genebank上面沒有
: 那你可以...
: 1. 丟BLAST找最接近的基因(總不可能是你排骨開天第一人吧)
: 2. 用找到的已知基因去做BLAST後 取最接近的前十個hit做multiple alignment
: 3. 找到conserved region(總不能可能你是排骨開天第一人吧)
: 4. 從 conserved region設計primer 如果conserved region不夠長就設計
:    degenerate primer   primer的3' 最好是放在conserved region上面
: 5. PCR, TA cloning, sequencing
: 6. RACE有點麻煩 其實不用這麼麻煩的

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◆ From: 123.195.13.23
→ Invec:你之前不是有說過要做RACE? 老闆不接受嗎
→ EDONIS:不接受!!叫我用Southern blot，我完全不懂怎麼用>"<
→ e5f6:Southern blot怎麼求全長 真不可思議
→ Invec:老闆可能看過 "第一次做DNA就上手" 這種書吧
推 puec2:用southern釣全長是傳統方式
→ puec2:先跑southern用原po的fragment當probe
→ puec2:理論上只會出現一到兩個band 然後再跑一次southern
→ puec2:把band相對應位置的gel挖下來去做cloning
→ puec2:因為是southern 所以理論上上面的band都是有切位的
→ puec2:直接塞進vector就好
→ puec2:得到的整盤colony再去做colony hybridizaion 找出帶有
→ puec2:一樣是用原po的fragment當probe 這時候會有訊號的colony
→ puec2:裡面就有可能帶有全長
→ puec2:最後對應回去 把colony挑起來 放大 抽plasmid
→ puec2:就可以了
→ puec2:southern我知道可以用dig
→ puec2:colony hybridization以前看人家都用isotope做
→ puec2:因為dig出現的時間點 大家都轉向做模式生物 都是有genome的
→ puec2:現在還能做到這種實驗 難得阿 難得
→ puec2:新手搞這個要搞一年吧
→ puec2:然後參考的方法和paper的作者應該退得退 死得死 XDDDDDD
→ e5f6:做得順手的一個流程也要各把月了，這方法真是匪夷所思XD