[求救] Western的 band看起來非常怪

[TW185930 (吱吱)]

我是做p67 phox的膜蛋白

之前實驗室沒有做過這個蛋白

 (抗體 是用santa cruz 的 sc15342 這支)

用pierce的kit抽膜蛋白

用10%  的 sds page去跑

blocking 用5% 脫脂牛奶 (室溫搖一個小時)

抗體的稀釋是用 3% bsa以1:1000稀釋 (4度C overnight)

wash 是用 TBST洗

二抗是1:10000稀釋 (用5%脫脂牛奶稀釋)

使用uvp 照膠

我的問題band 都連在一起而且還糊糊的(如圖http://i.imgur.com/fZeKPzm.png)

可是我的actin 就沒有這樣耶 (他們在同一片膠上)

actin 的band很正常

請問一下為什麼會這樣?? 有什麼解決的方法嗎??謝謝

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當他們關掉MegaUpload的時候，         我保持沉默；我還有FileSonic。
當他們關掉FileSonic的時候，          我保持沉默；我還有FileServe。
當他們關掉FileServe的時候，          我保持沉默；我還有MediaFire。
當他們關掉MediaFire的時候，          我保持沉默；我還有BT。
當他們關掉BT伺服器的時候，           我已一無所有了。

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.104.161
推 puec2:有 actin的圖嗎
補ACTIN的圖 http://imgur.com/GsH6Do3 感謝你
※ 編輯: TW185930        來自: 140.120.104.161      (06/13 19:33)
推 mingchao:lysis buffer 確認一下 以前配錯buffer 有跑出這樣來過
→ mingchao:分子量較大的就像你這樣 ACTIN都很正常~
→ blence:我猜不會是buffer,因為marker也是,而且這個p67跟actin的MW
→ blence:連差1倍都不到,很難說分子量影響
→ blence:我想猜把BSA換成milk就好
推 martyrtitan:........其實我直接猜是因為SC的抗體XDDDD
→ martyrtitan:另外..膜蛋白用Actin做internal?
推 puec2:應該是GEL裁太小塊 transfer的時候店場不均勻所造成
→ puec2:你可以試試看不要裁直接transfer
感謝mingchao blence martyrtitan puec2
好! 我試試看!
※ 編輯: TW185930        來自: 140.120.104.161      (06/14 13:30)
※ 編輯: TW185930        來自: 140.120.104.161      (06/14 13:38)
推 kakaman:膜蛋白應該要用membrane上的一些pump作control吧
→ kakaman:另外膜蛋白你用什麼方式煮?
→ kakaman:之前我在作600KDa的膜蛋白時,有位老師跟我說膜蛋白
→ kakaman:加sample buffer用37度西煮半小時
推 martyrtitan:membrane protein很容易聚集 要小心
推 keeny:你是抽哪種膜蛋白? 如果是plasma membrane不該跑的出actin!
→ keeny:如果是organelle membrane (ER or Golgi)那就OK.
→ keeny:假設你的一抗品質沒問題,我建議用RIPA製備protein lysates
→ keeny:之後再用sonicater確定充分的lyze membrane protein.
→ keeny:transfer應該問題不大 不然actin 不會如此漂亮
推 keeny:不過你的kit如果只能isolate membrane protein 的話
→ keeny:即使你收的是ER或Golgi你還是不能用actin.有可能是個不好kit
→ keeny:有一大堆cytosolic protein contamination.
我是抽NADPH氧化酶(細胞膜上的蛋白)， 我老師堅持說要 以actin當作control ......
※ 編輯: TW185930        來自: 140.120.104.161      (06/17 14:53)
推 greendeer:還是你要上超高速去做fractination?