[求救] qPCR苦手(新增擴增曲線 MELTING CURVE)

[naruto200420 (賤仔翔)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----


我的研究題目是將實驗室的基因默化香蕉轉殖株內的基因表現進行分析

我取香蕉果皮與果肉的sample抽取RNA做qPCR分析其內基因表現

問題點來了，每次跑Ct值跳動有點大，我都做4重複取其中3重複，而常常發現兩重複相似

= =  尤其是頭跟尾為同一值，中間又是同一值，導致計算誤差非常大，起初懷疑是pipet

error過大或者是RNA降解所導致，但是重作pipet稍微仔細，RNA也重抽過並有測品質，

但是一做到qPCR Ct還是不是很穩，但也不是每次都這樣，總是時好時壞，實驗室使用的是八連排的PCR tube，表面有霧狀處理

以上是使用one step的qPCR kit所做的

接續以上，由於我要分析的基因非常多，所以考量成本換成了2 step 的qPCR kit

也就是分成轉cDNA部分與qPCR部分，最近發生了有趣的事情，同一sample我以one step

kit可以測得Ct value，且擴增曲線與melting curve均正常，但是一拿去轉cDNA做2 step

跑出來的結果非常奇怪，擴增曲線上不去，只擴增一點點就停止上升了，得到的Ct value

也極其不穩定甚至讀不到，這原因到底是甚麼呢?我轉cDNA完全照著廠商給的protocol做

，qPCR也是，已經試了多次仍然如此....

想請問大家能幫我推測原因嗎?
qPCR所要求的RNA品質要到甚麼程度?
如果有需要更多資訊可以告訴我我會補上，請大家幫幫我QQ

今天我又拿之前第一次跑2 step qPCR的 sample來跑，結果居然跟失敗的組合一樣..

真令人崩潰...到底原因是啥...pipetman 汙染? cDNA降解了嗎...?

以下是圖
melting curve http://ppt.cc/KhKr
擴增曲線 http://ppt.cc/zZdi

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.243
推 liuse:你的Ct大約都是多少?20~30?還是超過30?
→ liuse:Ct越大 跳動頻率也會越高
→ wangba:2 step 的primer有測試過嗎?
→ naruto200420:Ct 通常介在20-25間，one-step和2-step所用的primer
→ naruto200420:是一樣的
→ ltc8031:你是用那一牌的儀器和kit? two step的cDNA你有稀釋用嗎?
→ naruto200420:我是取1ug/ul的RNA去轉成cDNA共20ul，跑qPCR就直接取
→ naruto200420:1ulcDNA去用了，之前有嘗試稀釋10倍但結果一樣
推 liuse:聽起來你沒有拉使用primer的linear curve?
→ Ianthegood:2step先去拉個50-65
→ naruto200420:測primer efficiency嗎
推 chaunen:先做個普通PCR看看有沒有band?
→ a90648:1ul體積太小了光pipetting error就會讓你數值亂跳
→ naruto200420:那要調成多少呢
→ naruto200420:2 ul夠嗎
→ a90648:我們家是稀釋10倍取5ul給你參考吧
→ roy047:pipetman也拿去校正一下?QQ
→ naruto200420:可是廠商的protocol寫cDNA體積不要超過總體積的1/10
→ naruto200420:我用的kit總體積為25
→ a90648:你們是用哪套Kit，說出來也比較好解決
→ naruto200420:Labstar qPCR kit
→ naruto200420:轉cDNA是用biolab的
→ naruto200420:來po圖讓大家看擴增曲線
※ 編輯: naruto200420    來自: 140.112.89.223       (06/26 18:25)