[求救] Western Blot 訊號很髒或是沒有訊號

[Kat0503 (米國貓)]

小妹我之前在台灣做Wetern Blot沒有遇上這些問題...
怎知道到了新實驗室之後就一直debug不了，希望各位出手相救 >"<

目標是要偵測分子量約140的蛋白

☆ 問題1:壓片時background超高!

試過改變blocking condition如下:
5%脫脂牛奶, 5% BSA, 5%FBS, 4度o/n, 或是 室溫 2~3 h 的排列組合
Buffer都是TBST

試過100V transfer 2h 或是 0.03A 4度 o/n

改變過washing的時間，從10min 3次到洗的天荒地老 (大約2~3h)

改變過2nd Ab濃度從1:1000到1:10000 室溫2h

以上方法都沒有用...

但是只要學長stripping掉重新染就很ok很漂亮

我問過學長的condition是5%牛奶室溫1h, wash基本上約45分鐘,2nd Ab 1:10000室溫2h

1st Ab都是Cell Signaling的rabbit polyclonal

☆ 問題2:大分子量蛋白消失!

這次是做 22V 冰箱中 transfer O/N, transfer完的液體還是涼的(biorad濕式)
同樣一片PVDF裁開，上半部染我要的target, 下半部染tublin
壓片時只有看到tublin的訊號
後來用ponceu S染PVDF,確定在大分子量那邊看不到band, tublin的band倒是很明顯

marker完整的到PVDF上，沒有殘留在膠上也沒有透到濾紙那邊


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以上兩個問題沒有同時發生，
但是我真的已經不知道該怎麼做了...

不知道提供的資訊是不是夠詳細，請大家幫幫忙救救人在國外孤苦無依的孩子

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 98.201.148.218
→ roy047:1:可附圖,較好判斷 2:與target size相近之marker確定有過?
→ roy047:還有 你和學長用的抗體是從同一管拿出的嗎?
圖在學校，明天補上
與TARGET SIZE相近甚至更大的marker都有完整的transfer過到PVDF上
我跟學長用的是同牌不同管，但我本身換過兩管了都是這樣...
我還換過SANTA CRUZ也一樣
※ 編輯: Kat0503         來自: 98.201.148.218       (06/26 12:10)
→ roy047:2.那sample loading量有嘗試增加過嗎? 確定壓得出來的量?
→ roy047:也可以嘗試完全照學長材料方法 或和他一起做一遍 較好debug
→ roy047:會回sample量是因為ponceu S染本來protein就會分佈不均了
→ roy047:並不是transfer的問題 細胞不同size protein含量本來就有差
有，我是照學長的量
他壓的時候SIGNAL超強的! 都還要等他稍微decay才能壓得漂亮
我們試過跑同管sample，但是他的就ok我的就不行... > <"
※ 編輯: Kat0503         來自: 98.201.148.218       (06/26 13:37)
→ roy047:那較可能是某個細節疏忽了orz 請他完整帶你做一遍較好
→ roy047:用一樣材料 一樣方法 一樣器材這樣
→ roy047:因為問題點在於 如果上述步驟有誤 學長應該也做不出來才對
推 puec2:最近也遇到一樣的問題 後來是發現 ECL沒有滴乾淨就直接
→ puec2:包進保鮮膜壓片 因為我們用得是很強的ECL 所以殘留的ECL
→ puec2:和free的二抗就把整片膜弄到髒髒的
→ puec2:以前看訊號很強的protein沒有這個困擾 壓一秒就超強
→ puec2:遇到需要壓比較久的protein 你又用很強的ECL
→ puec2:那一點點ECL殘留就可以把整片膜弄得很髒
→ puec2:最近一次乖乖的把ECL低乾淨(NC) background就少非常多
→ puec2:再不然就是最低級的錯誤 回去看一下TBS有沒有配錯
已經乖乖的把protein sample交出去給學長請他試試看~
然後已經約好時間要用他全套的東西跑一遍!
目前決定把所有buffer砍掉重練...
重配buffer之後如果還有一樣的問題可能就真的要再繼續找問題點了
※ 編輯: Kat0503         來自: 98.201.148.218       (06/27 12:16)