[求救]mice lung 的 total Akt 不表現?

[garlic774 (蒜頭)]

各位大大好~

我想看某藥物對primary cultre的Akt(total 或 phospho form)

然後拿mice 整顆 lung 當作 positive control

結果:

1. primay culture(有無加藥的組別)

   的total Akt or p-Akt都非常弱(protein量: 20 ug/ lane)

2. total lung 的 total Akt or p-Akt也都非常弱(protein量: 20, 50 ug/ lane)


抗體Akt:santa cruz(host:Goat; dilute:1:1000)

抗體p-Akt:santa cruz(host:Rabbit;dilute:1:1000)

兩支抗體"理論上"都應該壓得出來且背景乾淨(因為抗體是跟同學借來的

他壓的很clean>"<)

但實際上不是.....

二抗: 1:5000

3. 壓片時間:5 min /1 image，連續4張

4. 所以問題A:total lung 適合拿來用作Akt/p-Akt的positive control嗎?

             還是要用insulin/IGF刺激的cultured cell?

       問題B:一般的total 器官 protein 不會有Akt 表現嗎?

       問題C:p-Akt/total Akt可以染螢光嗎? 染螢光可以量化嗎?

       問題D:還是其實我壓的是對的，lung tissue沒有 Akt表現

             我的primary culture 加藥或不加藥也都沒表現

             所以根本不是這條路徑?


感謝看完~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.119
※ 編輯: garlic774       來自: 140.112.121.119      (07/03 22:54)
※ 編輯: garlic774       來自: 140.112.121.119      (07/03 22:54)
※ 編輯: garlic774       來自: 140.112.121.119      (07/03 22:58)
推 mesenchymal:你應該拿一株AKT/p-AKT表現得都很強的cell line當
→ mesenchymal:positive control
※ 編輯: garlic774       來自: 140.112.121.119      (07/03 23:30)
推 keeny:推薦cell signaling 抗體(AKT & pAKT), 我博班論文靠它很多
推 hsuwenli:你和你同學的blocking是同樣的嗎?如果是tissue
→ hsuwenli:或許你可以試看看用BSA blocking
→ hsuwenli:我發現很多人覺得好用的抗體,往往會因為blocking reagent
→ hsuwenli:不同而出現兩極評價,或許你可以參考看看
→ hsuwenli:pAKT或AKT細胞內一定有,所以一定壓得出來,只是表現量不同
→ hsuwenli:不過你沒放圖,所以我無法幫你辨別問題在哪,我只是以我的
→ hsuwenli:過往經驗回覆與你相似的問題
→ garlic774:感謝K大和H大  內文我的blocking buffer 是用BSA沒錯