[求救] 螢光染色實驗背景值

[A03692002200 (chen)]

目前實驗是單純只做簡單的螢光實驗~

實驗目的是想將細胞經過光照之後導致細胞凋亡或者壞死

所以使用ANNEXIN V-FITC/PI 方式染色

但是老師希望先做螢光染色判定有沒有就好

實驗步驟是將細胞用 PBS 清洗過後，

先加ANNEXIN V-FITC 染劑 10 分鐘

用 Binding Buffer 清洗3次過後

再加 PI 染劑 5 分鐘

再清洗

然後加入 Binding Buffer  之後，就照螢光顯微鏡

但是目前照出來的結果

染劑都有激發出來，也有順利染上

但是背景值太高

如果將背景值調掉，會連我要拍的細胞都消失

但是將我要拍的細胞亮度調高的話，背景值又太亮

就是亮度不夠，但是我將曝光時間加長也是一樣


目前是排除沒有清洗乾淨~因為我都會清洗3次~並且用shaker慢慢晃

比較有可能的是激發波長不對(不過之前學長姐也是用該濾鏡激發，拍出來很成功)

另一個是染劑太少(染劑量是 97.5μL Binding Buffer+2.5μL ANNEXIN V-FITC 染劑)



除了重染以外，老師是說看能不能將背景值去掉

所以想請教各位，以螢光染色來說

有什麼軟體或方法，可以將已經拍好的圖片，去除背景值?

因為已經試過ImageJ 跟Photoshop了 都無法很漂亮的將背景值去掉



或者是否有做過這個實驗的人~可以給一點建議呢 > <


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.119.63
→ apa9394:請問有圖嘛 能放個一張給版友看看嘛?
→ apa9394:如果條件沒抓到 signal太弱 硬調是不好的
→ vandia:這樣看起來..會不會是沒染上?
→ formoxa:要考慮沒染上或是根本沒有
推 oplz:如果只修改圖片的部份 (去除背景值) 就是改圖了
推 mesenchymal:還是重染比較好，不然初步確認自己都半信半疑了
附上一張圖

http://ppt.cc/0LOc

這是只有 annexin V-FITC 的圖~

因為硬調就很假的感覺~我也不敢亂調~"~

目前看是有染上~因為就在細胞膜外面一圈

目前是打算用蛋白激酶先誘發細胞凋亡做一組負向控制組

AND~

有人建議在染完ANNEXIN V-FITC 之後，先不清洗，直接加入 PI 染色 5分鐘

之後在一起清洗~

就打算先做一組試試了~
※ 編輯: A03692002200    來自: 220.137.114.11       (07/13 02:49)
→ vandia:喔喔 最後一次wash的時候用純的PBS試試看  (個人經驗)
→ vandia:1X PBS 不要用PBST
為何要用 PBS?

※ 編輯: A03692002200    來自: 140.135.101.144      (07/13 15:09)