[求救] inclusion body回融不出我的目標蛋白

[coco85101 (我不是李紋)]

各位好

我已經卡在蛋白純化很久了

希望大家可以救救我

我目前利用pET29-target protein(有His) transform到E.coli BL21(DE3)去進行表現

IPTG induction 4hrs後

開始以 1X Binding buffer 回融菌 破菌 (sonicator 0.8/0.8 Amp37% 1hr)
*500mM NaCl , 20mM sodium phosphate

破菌後離心 分為soluble form 和 inclusion body

inclusion body再以 1X 6M urea binding buffer回融O/N
*500mM NaCl , 20mM sodium phosphate , 6M urea

隔天離心後

發現我的目標蛋白沒辦法回融在含6M urea的binding buffer內

學長姐以前也從來沒遇過這種問題

我的目標蛋白不是膜上的蛋白,沒有signal peptide , 有兩個ZinC finger

也確定過已經大量表現了

且破菌時間蠻長的，應該菌都打破了阿


請各位救救我啊....


謝謝


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 218.164.26.209
推 puec2:菌早點收試試看。
→ puec2:比如說不要induction 4小時, 做個 1, 2, 3小時 或者調整
→ puec2:induction條件, 調整IPTG濃度 方向是低溫 低濃度
→ puec2:以前表現RNA polII CTD, 有人要我在18度induction
→ puec2:忘了幾小時還是overnight 照著做就出來了
→ storm780121:全菌有表現嗎?
→ dehydrogenas:induction以後改培養的時間成28度看看