Re: [求救] Dual-Luciferase 的 Internal control

[puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)]

真是新奇 第一次看到可以用其他promoter增強luc的表現量的做法 請問這樣transcription initiation site算誰的？ 算妳的promoter還是SV40 promoter? Enhancer如妳所看到的也有可能干擾SV40 活性 總覺得這個方法不太對
妳現在該做的就是直接測沒有SV40 promoter狀態下的活性 因為妳是用fLic 所以我假設沒有sn比太低的問題 如果活性太低可以試試看用Gausia luciferase or Nano luciferase 總之我覺得用其他promoter來增強 是很難理解的一件事

※ 引述《xxtomnyxx (翼天)》之銘言：
: 請教一下，
: 由於我所使用的 promoter/enhancer 屬於較弱的類型，
: 之前教我 Luciferase assay 的老師是建議是把我想研究的基因的
: promoter/enhancer 接到 pGL3-promoter-vector 上，
: 利用上面的 SV40 early promoter 增強 ffLuc 的訊號。
: 現在我遇到一個問題，
: 如果我懷疑我的實驗操作也有可能會影響到那段 SV40 early promoter，
: 也因此每做一次實驗我都還要做 pGL3-promoter-vector 的 control。
: 我想問的是：
: 我能不能把 pGL3-promoter-vector 上的 ffLuc 換成 rLuc，
: 用這個 rLuc 當作 internal control 去消除實驗操作對 SV40 early promoter 的影響？
: 同時 transfect 這兩個有許多相同序列的 plasmid 到細胞內，
: 會不會影響我的實驗結果？
: PS: 原本用的 internal control 是實驗室自己做的用 UbC promoter 表現的 rLuc。

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◆ From: 219.80.238.185
→ xxtomnyxx:直接測沒有 SV40 promoter 的部分我正在準備材料，但是
→ xxtomnyxx:我覺得讀值可能會低的很危險，所以先來問問後被方案。
→ aceliang:hmm，gaussia是分泌型的luc，定量上要很小心。
→ xxtomnyxx:使用那段 SV40 early promoter 還有一個考量，就是如果
→ xxtomnyxx:我 clone 到的是 enhancer 而沒有 promoter，那段序列就
→ xxtomnyxx:可以用來做為我的 enhancer 的transcription initiation
→ xxtomnyxx: site
→ puec2:所以你不確定你的序列是不是promoter?
→ puec2:如果把序列clone到pGL裡面沒看到活性，或者活性超低
→ puec2:不就已經說明問題了...
→ puec2:另外你推文對enhancer的敘述我其實完全看不懂。
→ puec2:luciferase超敏感的，沒有東西就是沒有東西。
→ blence:當然可以用SV40,可以看一下pGL3其他的vector,比較差別在哪
→ blence:一般都用pGL3-basic,但你可以換成pGL3-promoter或enhancer
推 windyflyer:nano很強非常強 我們家測之前三小時換medium還會有幾百
→ windyflyer:萬的讀值!不過有趣的是nano不能跟renilla一起表現 因為
→ windyflyer:co-transfect的細胞刮下來測renilla會跟著飆上去..
→ puec2:哪有很強 剛剛測只有幾萬...-_- 算正常
→ puec2:不過background很低 只有幾百 可以接受