[求救] medaka冷凍切片 及 HE染色(已爬文過)(急)

[dearetet (忙碌者~)]

各位大大好

現在我在做 medaka 的冷凍切片 及 HE染色
(之後要繼續做 免疫染色、骨骼染色及細胞凋亡的染色)

但是卡在，切片一直都切不好，切片前處理條件一直試不出好的結果
(組織都會破損)(主要觀察腦和眼睛)

版上的方法有參考(畢竟sample不是medaka)網路的資料也參考過，但切出來就是都不好


以及HE染色，染色前和染色後，組織會有破損的情況，
有時切片甚至在染的時候切片會掉下來(只有一部分)

所以在此想問問各位大大，有沒有建議的切片前處理和HE染色的步驟，或是其他染色的步
驟

在下方我會列出我切片的處理方式和HE染色的步驟，
不知是否可以修正的地方
(本來想附上照片，但照片很多，有需要看照片的，可以提出，謝謝!)

先感謝大大!

一、切片前處理

1.
 4% (paraformaldehyde)PFA + 30% sucrose，RT，8H，用Rocking shaker 30 rpm
 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱小於30分鐘後切片。
 厚度10 um，溫度-15 ℃。

2.
 4% PFA + 1X PBS +  5% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H   →
 4% PFA + 1X PBS + 10% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H   →
 4% PFA + 1X PBS + 30% sucrose + 33%OCT ， 4度C，O.N
 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱，2H後切片。
 厚度10 um，溫度-15 ℃。

3.
   5% sucrose ， 4度C，1H  →
  10% sucrose ， 4度C，1H  →
  20% sucrose ， 4度C，1H  →
  30% sucrose ， 4度C，1H
用試鏡紙將水分吸乾
用保鮮膜包住sample
放入 - 20度C 2H
放入 - 80度C 4H
將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並
擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片

厚度10 um，溫度-15 ℃。

4.
  5% sucrose ， 4度C，1H  →
 10% sucrose ， 4度C，1H  →
 20% sucrose ， 4度C，1H  →
 30% sucrose ， 4度C，1H  →
 50% sucrose ， 4度C，3H  →
用試鏡紙將水分吸乾
用保鮮膜包住sample
放入 - 20度C 2H
放入 - 80度C 4H
將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並
擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片

厚度10 um，溫度-15 ℃。

5.
 5% sucrose ， 4度C，1H  →
10% sucrose ， 4度C，1H  →
20% sucrose ， 4度C，1H  →
30% sucrose ， 4度C，1H  →
50% sucrose ， 4度C，3H  →
 4% PFA     ， 4度C，1H
用試鏡紙將水分吸乾
用保鮮膜包住sample
放入 - 20度C  O.N
放入 - 80度C  2H
將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並
擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片

厚度10 um，溫度-15 ℃。

6.
 5% sucrose ， 4度C，1H
10% sucrose ， 4度C，1H
20% sucrose ， 4度C，1H
30% sucrose ， 4度C，1H
50% sucrose + 4% PFA + 1X PBS + 33% OCT ， 4度C，3H
用試鏡紙將水分吸乾
用保鮮膜包住sample
放入 - 20度C  O.N
放入 - 80度C  2H

將SAMPLE 取出，放入裝有OCT的TUBE蓋子中，擺好位置後，放入-15度C(切片機溫度)，變
白後切片

厚度10 um，溫度 -15℃

※切出來的切片直接用玻片貼片，全部切完後直接染色或放入4度C冰箱保存

--------以上是後期試過的方式，結果都不讓老師滿意，怎麼做可以更好呢?----------

※HE染色

將切好的切片從4度C冰箱取出並回溫

˙玻片用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒。
˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。
˙以Hematoxylin染5秒。
˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。
˙處理85% Alcohol 1分鐘。
˙再用Eosin 染5秒。
˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。
˙用95%、100% Alcohol各脫水1分鐘。
˙放入100% Xylene 10分鐘後封片(蓋玻片與Permount)。

這樣染色的步驟需要修改嗎?

第一個步驟  用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒

會掉片是因為這步驟的關係嗎?拉長時間會比較好嗎? (老師覺得不是這一步驟出問題)


問題很多~先感謝大大 提出一些建議~我已經測試了兩個月了~希望可以繼續下去!


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※ 編輯: dearetet        來自: 192.192.199.49       (07/29 19:25)
→ short945:冷凍切片，大多數的腦組織都會掉，解決法就是用吉利丁
→ short945:組織會破，可能是切的東西有很大的硬度差異，例如水晶體
→ short945:如果是H&E染後看起來細胞破破的，就是凍壞了
→ short945:解法-固定-跑SUCROSE/PBS梯度到30%-等組織沉下去-冷凍-切
→ short945:大腦可不包OCT，溫度調高一點點-10 到-15間，祝好運
→ dearetet:感謝S大的建議~
推 h3250sam:放張圖給大家研究看看吧~
→ dearetet:感謝H大的建議~我晚點再PO照片幾張照片上來~