[求救] 關於colony PCR之問題

[TWX5566183 (塵世中一個迷途小五六)]

如題 要把A plasmid上的基因片段 接到 B plasmid上頭

A B兩種plasmid上都有CMV promoter

基因片段(A plasmid)為2K

Vector(B plasmid)為8K



原PO的實驗步驟如下

1.restriction enzyme digestion

使用XbaI 和 NheI兩個酵素同時作用 overnight 切Vector和 insert

因為XbaI 和 NheI的切位可以互相接起來 所以我使用了CIP處理Vector



2.Ligation

隔天將DNA片段經由gel extration後ligation 接著塗盤養overnight

以1:3 molar ratio Ligation



3.colony PCR

隔天長出菌落之後做colony PCR

以CMV primer作為forword

以基因上有的序列設計primer作為reverse

因為不管在A plasmid上還是我的新construct都是以CMV poromoter接著我的目標基因

所以我以A plasmid作為 positive control 大約300bp

但我的新construct卻P出一堆雜band 與positive control不符

挑了大概六十顆 結果完全相同


無法解釋這個現象 跪請版上強者幫忙

謝謝...

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.109.40.39
→ blence:挑60顆,我覺得一個construct挑超過6顆,重做比較快
→ blence:8k,應該是viral vector吧,如果是,看colony大小就能先排除了
推 mesenchymal:有做vector only control嗎?
→ jazzdevil:CIP處理需要改進，做不好容易這種結果
推 puec2:一樓專業
→ puec2:另外雜band多 可以調高annealing temperature試試
推 ararthur:請問viral vector 的colony是會比較小嗎? but why?