[求救] real-time PCR Ct值疑問

[naruto200420 (賤仔翔)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

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每次做real-time PCR，做四重複，結果Ct會產生兩兩分群的現象，也就是數值兩個兩個

相近，造成取值非常的困擾，但是melting curve卻是很有專一性的，之前懷疑是pipet error的

現象，所以嘗試放大體積來加cDNA，可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類

似的經驗嗎?

另外加試劑的順序，氣泡存在與否，是不是會造成影響呢?

我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分別加入8聯排，再加入

cDNA，希望大家可以幫幫我啊QQ

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◆ From: 140.112.4.209
→ roy047:氣泡在一開始加熱時就會破光了吧?
→ roy047:順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題
→ untilnow:換一排做  可能某幾個孔加熱有問題
→ naruto200420:那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留
→ huuban:我去的實驗室是不用8連排的..
→ ai760721:我都不用第二段 我覺得第二段出來有時候會黏在tip上
→ naruto200420:不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD
→ naruto200420:NA不推二段
推 mesenchymal:我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen
→ mesenchymal:一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎?
→ jsi:數值兩群差距有多大?  如果方法對，做三重覆即可，偶數組重覆
→ jsi:有點自找麻煩哪...
→ mesenchymal:如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題
→ naruto200420:如果cDNA降解會這樣嗎?
→ naruto200420:其他人也有Q_Q
→ naruto200420:兩組ct大約差0.7-1.5