[求救] 細胞RAW264.7培養繼代問題

[arile1989 (榕果)]

我想請問養過這株RAW264.7的細胞株嗎?

我目前正在做細胞的繼代
但是Passage2~3次後
隔天去看細胞幾乎都活化了


細胞來源:BCRC

培養基:90% GIBCO DMEM 的 Power with 4mM L-glutamine,
       4500mg/L Glucose 另加1.5g Sodium bicarbonate
       10% GIBCO 的 FBS

繼代方法: 1.滿盤時,吸除舊的medium,加入1ml新鮮medium至25T來刮細胞
          2.吸取 1ml細胞溶液和9ml新鮮medium在15ml離心管均勻pipette
          3.以1拆5去分盤


我的問題有以下4個
1.Passage2~3次後,隔天去看細胞幾乎全部都活化了
2.是否是繼代方法錯誤?還是中間步驟有需要改進的地方?
3.是否是medium中L-glutamine沒有再補充的原因?
  (原本medium中L-glutamine的濃度是足夠的)
4.是否是FBS的品質不夠好,還是Medium要買Liquid的?


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◆ From: 1.165.121.81
推 utadalove:我們家也是用刮的,10cm plate 用6ml去刮!都沒什麼問題@@
→ utadalove:我們DMEM用powder配的,內容的成分跟你的差不多
→ utadalove:25T用1ml去刮,medium可以cover住底部嗎?會有乾刮的情形?
推 snowcyn32:滿盤多滿啊 太滿也會活化 8分滿應該就差不多了
→ arile1989:n+1時確實有細胞過滿,且那時繼代時有乾刮的情況
→ arile1989:之後有聽BCRC的建議,用75T和10ml的medium繼代
→ arile1989:但是細胞還是都活化了@@
→ apa9394:不管是ATCC 還是其他單位的細胞 有再現性才是比較重要
→ apa9394:來源已經都混亂不堪的情況下 要想的是怎樣和PAPER呈現一樣
→ apa9394:或類似的結果 信心才會夠強
→ apa9394:也有細胞在美國的實驗室 來台灣一直無法再現
→ apa9394:光是實驗條件的掌控 就是很辛苦的部分 不過建議你
→ apa9394:多跟幾個實驗室要 或許 會找到答案
→ apa9394:無須花太多時間抓條件 很多時候是細胞本身的問題
→ apa9394:要有效率的話 換細胞比較實際
推 iyogirl:我用10cm dish 1/10比例去分 約兩天會五成滿 分盤 1/20可
→ iyogirl:撐3天 5% FBS DMEM 五成大概會有1x10e7(兩天)三天會2x10e7
→ iyogirl:如果有3成活化就可以放棄那一盤 我是用刮的繼代
→ iyogirl:刮棒會用酒精消毒後reuse
推 panyuyun:繼代RAW細胞我都直接用DMEM沖細胞，沒有用刮棒耶
推 robin:請問一下  如何從細胞外觀判定RAW264.7細胞活化了呢?
推 utadalove:會成星狀,很多觸角
推 robin:謝謝U大回答 ^^
推 umijuki:換endotoxin-free或low endotoxin血清試試，但成本高很多
→ umijuki:以前我也養這株，嬌貴的丫…
推 hsnuyr:我們家是用BCS 比較沒有活化的問題 繼代用PIPETING的方式
→ hsnuyr:打下來 有開始活化的話明顯會比較難打