[求救] 關於shRNA knockdown效果

[jordan01405 (空)]

大家好，小弟我最近實驗遇到些問題

我用shRNA 去knockdown，前面的塗盤養菌都OK
1.抽plasmid，濃度和定序OK
2.transfect到293細胞，螢光OK(24hr有50%)
3.抽RNA，濃度OK
4.RT-PCR
5.QPCR

但是QPCR的結果: CT值感覺沒有什麼變化
看不出K.D.的效果


請問大家有沒有遇過類似問題~或是有什麼好的解決方式~
謝謝大家~

P.S.shRNA序列是參考ABI公司的序列


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 123.195.162.84
推 huuban:RT-PCR有看出差異嗎？
推 ljii:這可能性太多了,扣除技術性問題,最可能的就是這個shRNA不work
→ ljii:一般都是作好幾個shRNA看哪個work,效果最好
→ ljii:比較保險的作法是找paper有證實的shRNA來用
→ ljii:如果是照著一般guideline來設計, 就要多作幾個
→ supray:通常1個target會設計約5個shRNA去試
→ jordan01405:RT-PCR沒什麼差異
→ jordan01405:我一個target設計3個~總共有2個target~可是兩個都沒有
→ jordan01405:看出Knockdown的效果
→ jordan01405:還是有可能他們都不Work~還在想是要重新transfect
→ jordan01405:還是應該要重新再設計shRNA
→ jordan01405:我選的序列是abi公司做過的~他們也做過可以成功
→ jordan01405:所以兩個還是太少嗎?
→ jordan01405:謝謝你們的回應~
→ puec2:你現在還會覺得shRNA比較省嗎? :)
→ blence:如果序列是自己接的，很可能是銜接的設計不對
推 galectin:同樣的序列在不同細胞上的效果會不相同
→ galectin:可以嘗試RNAicore的shRNA，個人覺的非常省又好用
推 jsi:順帶請教一下，若RNA有Knockdown但protein level沒差異，通常
→ jsi:會再做那些測試呢? 還是逕行使用其他shRNA?
→ xxtomnyxx:你 transfect 後多久做 cell lysis?
→ xxtomnyxx:Protein 如果半衰期比較長，就算 RNA 減少了還是能再
→ xxtomnyxx:細胞中持續存在一段時間。
推 jsi:三天72h。如果是半衰期長的protein，用RNAi knockdown的方法要
→ jsi:探討後續功能變化是否不可行? 有甚麼管道可以搜尋是否為半衰期
→ jsi:長的protein嗎?