[求救] Confocal螢光定量問題

[mikis1107 (mikis1107)]

求救求救!!!

之前我用confocal看雙染分子的螢光量

一共三個分子 A B C
主要目的看A+B A+C的% of colocalization程度

第一次雙染 A (紅光,二抗是M)+B(綠光,是已經接上螢光的抗體)
第二次雙染 A (綠光,二抗是M)+C(紅光,二抗是R)

-->我知道A應該都染同一種顏色才對
   但因為B與C是老闆指定要呈現的顏色所以才把A的顏色換掉

本來想換螢光顏色應該對於其分子的螢光表現量不會差太多
但是現在問題來了!!!
就是有差!!

原本第一次雙染看三組檢體(NC,與其他兩組病人檢體)
螢光量比例為 1:2:2.2
第二次染的檢體螢光比例卻變成 1:2.2:2.7
(螢光量都已經減去各自的background了)

難道同一個分子同樣抗體濃度
染色的condition都一樣的狀態下
(從固定, blocking,一抗濃度二抗濃度,wash時間通通一樣)
染不一樣的螢光表現量會差異到快一倍嗎??@@a

被老闆一問一整個不知道該怎麼回答~
請問有concocal達人可以幫幫忙嗎??
有沒有甚麼解釋方法呢??

感激不盡!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 36.238.36.127
推 conective:看不太懂 3組檢體是哪三組? 第一次只看A+B嗎?
三組檢體是Normal control(NC)
病人第一組(10位病人)
病人第二組(10位病人)

是的
第一次只看A+B
A分子的螢光(紅光)
三組檢體螢光比例是NC:病人1:病人2=1:2:2.2

第二次看A+C
A分子的螢光(綠光)
NC:病人1:病人2=1:2.2:2.7

推 conective:即使同樣抗體濃度不同抗體可能會有差異唷
一抗二抗的濃度都一樣的話也會嗎??

→ puec2:你要不要寫英文?
哈哈哈哈
我...我英文不太好@@a

→ microball:你有用二抗嗎？如果二抗不一樣，強度不同很正常
有二抗
A分子的二抗是Mouse-FITC(綠光)  Mouse-TRITC(紅光)
那這樣的話可以跟老闆說
"因為我街的二抗不一樣所以導致A分子螢光強度也有差異嗎??"

但他會問我為什麼會有差異...是甚麼原因造成這種差異性..@@a

推 skyofsilver:問一下 曝光強度有調成一樣嗎?
你是說紅光跟綠光的曝光程度嗎??
三組病人在各自雙染的曝光程度一樣沒錯(曝光數值調成一樣)

但是第一次的紅光與第二次的綠光曝光數值不一樣
因為在confocal上看起來
同一個分子染紅光表現量是比綠光來的弱一點點
也就是第一次雙染的A分子是看起來比第二次的A分子弱一點

不過因為都是跟NC做比較
就算表現量稍微弱一點
理論上除起來的倍率應該也要差不多才對吧T__T

→ puec2:倍率不會一樣吧..
→ puec2:NC的強度是non-specific binding程度決定 訊號強度是
→ puec2:Specific binding強度在決定..
喔喔報告學長(姐)XDD
NC是指買來的正常組織切片
Normal control
是沒有病的人類檢體切片
A分子也會表現在正常組織中
只是量應該沒有病人多

→ puec2:不同顏色就是不同抗體 這麼多變數怎麼可以直接比
→ puec2:除非你的negative control也有訊號 那就當我想太多 XD
推 qiet:不同的螢光分子激發後的螢光強度會不一樣
嗯嗯
我知道
但是兩次染色三組檢體都是同時處理
跟NC比較起來的倍率是否也應該要接近才是??
※ 編輯: mikis1107       來自: 114.137.27.122       (08/19 14:27)
推 jsi:精華區Z>7>16>2>2有討論螢光定量。不曉得confocal跟flow是否
→ jsi:類似，flow雙染情況下須進行compensation，confocal就不知是否
→ jsi:也要進行這步驟? 直接請教confocal specialist也是方法之一
推 puec2:因為你是用比的 有沒有可能第一次染色紅光已經saturate?
→ puec2:所以倍數拉不開
→ haoen:同樣一個片子 綠:紅 不等於 紅:綠.
推 Tubar:即使你上述的condition一樣 室溫也是影響反應的原因之一 更
→ Tubar:不用說你二抗用了不一樣的抗體了 如果這樣做出來的數值一樣
→ Tubar:我才覺得比較奇怪