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餓死抬頭…… 接下這個任務也大半年了,但是做得依然很爛,也不知道是哪裡有問題 所以才上來請各位幫幫小妹我(跪) 我的實驗是用ELISA測定Plasma中的3-Nitrotyrosine濃度 先前情提要一下,我以前完全沒做過ELISA,在這部份我完全NEW 使用的KIT是CUSABIO的,使用的八爪是Eppendorf家的 原廠建議是用4-parameter去計算(我的愚婦腦袋只知道線性,對這玩意兒真的沒概念) 最低可偵測範圍是0.156 ng/ml 起初開始做的時候是duplicate的CV太大 但是我看了看data,我覺得是因為檢體的OD值都很低的關係,差一點點CV就爆20%了 雖然對結果的計算是沒差,因為duplicate的結果都是<0.156ng/ml 但老闆說「不行」!!!手法穩的話應該可以控制在20%以內 為了這20%我真的都快哭了…… 我加完檢體後就37度 incubation 2小時,完了之後接著就是把檢體直接甩掉拍乾 原廠說明書是寫不用wash 不知道是不是因為這個步驟的關係造成CV過大 所以後來我都先用八爪把大部份檢體吸出來後再拍乾 雖然有改善,但老闆還是覺得CV不該是這樣,應該要更小更漂亮才對 他覺得我是做分生的平常都1ul、2ul在加,現在給我加100ul應該沒問題 CV應該要更小 想請問大家在拍乾plate的時候有什麼訣竅嗎? 我都覺得每次拍的時候都會交互汙染的感覺 我看其他人都是直接倒扣,然後就開始啪啪啪狂拍 這樣真的不會交互汙染嗎???? 最近一次操作的問題是我的4套QC中有2套沒過,還跟Target value 差很多... 而這沒過的2套都是放在第3條well,我真的不知道是發生什麼事了… 但這次老闆似乎非常的生氣…… kit很貴,但我卻一直做不好 打到這心情又好down 先謝謝大家看完 因為現在手上沒有實驗的data,等明天到實驗室再補上來請大家幫我看一下 現在整個一團亂,很沒有頭緒的感覺也不知道是哪裡有問題 再次 感謝大家看完我的落落長廢話 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 1.171.165.235
raiyu:sample可以4度 overnight (其實我也是小嫩嫩) 08/20 22:32
snowcyn32:我也覺得4度 overnight做出來比較漂亮 08/20 22:53
snowcyn32:拍乾也是劈哩啪啦亂拍 08/20 22:53
e123917123:盡量垂直朝下 比較不會污染 拍乾底部墊衛生紙 拍過後再 08/20 23:36
e123917123:換另一面乾淨衛生紙部分去拍 應該不會污染 做這個 寧可 08/20 23:37
e123917123:多浪費點衛生紙 為求實驗精準 08/20 23:37
e123917123:有的人做就是固定定點的拍 但是我都怕污染別的well 所 08/20 23:39
e123917123:以會一直換紙 08/20 23:39
gundamhaha:盤子底面有乾淨嗎? 08/21 08:53
wig152003:是說我在讀OD值之前都會先把WELL底部擦一下欸~ 08/21 13:28
formoxa:做VEGF這種簡單的不用4度就很漂亮了 08/21 16:07
jsi:閱讀了幾家廠商的3-NT ELISA protocol,發現大多是在加sample 08/21 23:32
jsi:的步驟就同時加入detection solution,您用的產品步驟是remove 08/21 23:34
jsi:the liquid, don't wash.大概是3-NT不容易與capture Ab or 08/21 23:35
jsi:something結合,所以使用remove一字而不寫aspirate,大概須小 08/21 23:37
jsi:心移除liquid,不要再拍打吸乾,就進入下一步驟。 08/21 23:40
flyninja:有個問題想借此文發問 我的kit在wash的時候well內會有約 08/22 00:56
flyninja:300 ul的wash buffer 前陣子做也都是直接垂直朝下倒掉 08/22 00:57
flyninja:發現好像還是會有溢出的現象 因為盤子邊邊都濕濕 08/22 00:58
flyninja:後來有嘗試過先把wash buffer先用八抓吸掉再倒 就有改善 08/22 00:59
flyninja:只是這樣是每吸完一排 就要換一次tip嗎?不然還是會有 08/22 01:00
flyninja:交叉污染的現象? 08/22 01:01
planter:要注意八爪的TIP有沒有插緊 否則有些WELL會少加很多 08/22 09:04
ararthur:同一支八爪有人用過嗎? 會不會已經不準了 08/23 12:17
jsi:真的會因此而交叉汙染嗎?我用R&D ELISA kit說明書裡講到wash 08/24 17:22
jsi:有一種方式是用洗瓶將buffer灌到well中wash,不要直沖well底面 08/24 17:24
jsi:之後甩掉buffer,並在擦手紙上拍打,這個方法沒有問題。倒是要注 08/24 17:25
jsi:意若沒有拍乾(指well中沒有殘留液體,並非完全乾燥)實驗數據再 08/24 17:27
jsi:現性不佳。實地看別人全程操作一次或換手做做看,可略知是產品 08/24 17:29
jsi:有問題抑或操作手法待改善。 08/24 17:30
duncanfang:八爪使用前可以檢查一下O ring ,把tip插緊(不管吸 08/27 08:02
duncanfang:或加都一樣) 08/27 08:02
gestapo:實驗室有其它前輩做出過嗎? 08/28 15:07