Re: [求救] Hif1 alpha看不到band

[xiphos (火柴人@@)]

※ 引述《jas123654 (jack)》之銘言：
: 如標題
: 小弟目前要針對hif1 alphe做western
: 但是一直看不到band

不知道您是用哪種方式進行hypoxic treatment?
如果是用hypoxia chamber的話收lysate的時間就需要越短越好

: 小弟實驗室在收lysate是先加PBS
:  收到沉澱物後才加lysus buffer(RIPA NaF PI Na3VO4)
: 爬了下舊文  似乎有人覺得應該先加lysis buffer
: 我覺得是不是用PBS刮細胞的時候我的Hif1就被degrade光光了
: 不知道有沒有高手能解惑的?

我的作法是先用足量的cold PBS很快的wash過一次,然後直接將lysis buffer加到culture plate中
將細胞打破後再把lysate收下來。
在我的認知中HIF1a就是一個對環境氧氣非常敏感的蛋白所以所有動作當然是越快越好。

: P.S.  CoCL2作為positivve control有押出來漂亮的band
: 所以可以排除跑膠 transfer 抗體 ECL的

如果可以附圖的話會更好

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 124.8.142.142
推 jas123654:我原PO  我是用CoCl2做positive control
→ jas123654:induce hypoxia是用藥物(不方便說) 但學長的DATA
→ jas123654:normoxia其實還是有淡淡的BAND 所以我懷疑我的都被分解
→ xiphos:normoxia的band大約是在哪個位置呢? 是在正確的位置上嗎?
→ jas123654:normoxia跟hypoxia band一樣位置  在120KDa