[求救] 新手想仔細請教電穿孔法步驟

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小弟目前正要開始嘗試用電穿孔法 overcross兩段基因

大致上的流程是懂了，但是一些細部的部分不是很了解

從一開始拿出-70度C的菌液就不太懂



1.拿出菌液後置於冰上，待其微溶時取 5ul加至 5ml培養液中震盪隔夜培養

2.隔日從過夜菌液中取 50ul加入 10ml培養液中震盪培養 2hr開始每20分鐘測一次OD

3.待OD=0.5時冰浴10分鐘，在4度C下以4000rpm離心10分鐘

4.倒掉上清液並以 10ml滅菌水輕輕的沖混，然後再同條件離心10分鐘

5.倒掉上清液並以 5ml滅菌水輕輕沖混，以同條件離心10分鐘

6.最後加入 1ml含10%甘油的冰冷溶液沖混，後以 100ul分裝保存於 -70度C



第一個疑問，步驟1 這樣是可以的嗎？還是要先做一些處理？

第二個疑問，步驟5 當中所提到個甘油溶液是甘油+滅菌水？

第三個疑問，如果我今天要進行電穿孔法了，那含甘油的勝任細胞是直接可以使用？

第四個疑問，我在其他crossover的文獻上有看到設計另外一段篩選的基因
如果是電穿孔完、塗plate然後直接送定序檢查這樣需要設計那段基因嗎？



最後一個問題...小弟的質體總長度大概 8K bp左右
用一般的熱休克法可能成功做出crossover嗎？在質體上共有前後各 50bp的同源序列
而同源序列夾住的基因長度約 1.6K bp，欲取代位置的基因長度也約 1.6K bp



如果有缺條件的我會再補述

感謝

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.163.252.247
→ Invec:你要做E.coli的電穿孔嗎? 如果是的話 1 2 3 的答案都是yes
→ Invec:第四個問題如果要送的基因沒有selection marker 那要怎麼篩?
→ Invec:這樣會挑不到單一菌落送定序 有沒有考慮換小一點的載體
是要做 Pseudomonas putida的電穿孔
嗯...第四個問題我基因丟進去之後會製造PCA，我是打算配plate，加入會使PCA顯色的藥品
進而挑選有使周圍變色的菌落
※ 編輯: a72830044       來自: 140.123.126.147      (09/04 11:20)
→ Invec:電完之後記得做不同體積的塗盤 有可能菌落會長的太密不易挑
感謝，我大致上瞭解了！
※ 編輯: a72830044       來自: 140.123.126.147      (09/05 00:01)