推 a72830044:感謝，我會認真做的！ 09/05 00:02
※ 引述《a72830044 (a72830044)》之銘言：
: 小弟目前正要開始嘗試用電穿孔法 overcross兩段基因
: 大致上的流程是懂了，但是一些細部的部分不是很了解
: 從一開始拿出-70度C的菌液就不太懂
: 1.拿出菌液後置於冰上，待其微溶時取 5ul加至 5ml培養液中震盪隔夜培養
不需要等菌液"溶" 直接用tip戳一些冰塊下來 丟進medium裡面養即可
: 2.隔日從過夜菌液中取 50ul加入 10ml培養液中震盪培養 2hr開始每20分鐘測一次OD
10000/50=200倍 有點高 我大多習慣500X稀釋
: 3.待OD=0.5時冰浴10分鐘，在4度C下以4000rpm離心10分鐘
0.5算少 0.5~0.7都可以
: 4.倒掉上清液並以 10ml滅菌水輕輕的沖混，然後再同條件離心10分鐘
這步OK
: 5.倒掉上清液並以 5ml滅菌水輕輕沖混，以同條件離心10分鐘
這步倒上清液的時候 pellet可能會很鬆 要小心
: 6.最後加入 1ml含10%甘油的冰冷溶液沖混，後以 100ul分裝保存於 -70度C
要先過乾冰或者液態氮再放進-80
: 第一個疑問，步驟1 這樣是可以的嗎？還是要先做一些處理？
不用
: 第二個疑問，步驟5 當中所提到個甘油溶液是甘油+滅菌水？
是配好的10%glycerol拿去滅菌
: 第三個疑問，如果我今天要進行電穿孔法了，那含甘油的勝任細胞是直接可以使用？
可以
: 第四個疑問，我在其他crossover的文獻上有看到設計另外一段篩選的基因
: 如果是電穿孔完、塗plate然後直接送定序檢查這樣需要設計那段基因嗎？
有selection marker當然是比較好 要看你的用途
: 最後一個問題...小弟的質體總長度大概 8K bp左右
: 用一般的熱休克法可能成功做出crossover嗎？在質體上共有前後各 50bp的同源序列
: 而同源序列夾住的基因長度約 1.6K bp，欲取代位置的基因長度也約 1.6K bp
crossover效率不高 所以當然是希望transformation效率越高越好
用電的比用燙的效率高了100~1000倍..
: 如果有缺條件的我會再補述
: 感謝
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