[求救]Tag cloning

[galectin (半乳醣凝集素)]

   各位前輩們好，我想constract一個 overexpression
的plasmid，但這個基因沒有市售抗體，所以想要在我的
insert中加入Flag當作tag，想請問前輩們是否只要在
foward primer當中，在stop codon前面直接加入gat tac
aag gat gac gat gac aag就可以了?
(我目前是把stop codon拿掉)
但這樣一來foward primer就會有過長的問題，若是加上9個
Res site及21個mer，再加上flag就會有54個mer，這樣是否
會影響PCR效率。
有看到版上前人比較推薦flag tag，想請問是否在C treminal
接flag比較不會影響蛋白結構呢?
麻煩前輩們幫我解答，感激。

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◆ From: 210.60.122.10
※ 編輯: galectin        來自: 210.60.122.10        (09/09 17:34)
→ Ianthegood:做了才知道啦 都是這樣
→ blence:許多方法,1.是去找已經有tag的vector,2是先用兩條primer做
→ blence:anneal之後塞vector,或用site-direct塞,3.是你這樣一起併做
→ blence:先tag塞進vector的好處是以後做cloning就可以用得到
→ blence:至於N或C的影響，真的是做了才知道
→ soom:我以前常做跟你一樣的設計，primer品質要稍注意
→ galectin:謝謝各位前輩，因為已經有選好載體了，所以只能外加
→ galectin:我打算選用生工primer的page純化，不曉得品質好壞
→ galectin:想再請問一下，Foward有30mer，Reverse 54個mer
→ galectin:有必要把F也補齊到50個mer左右嗎
推 chaunen:tm值差異小於1~2度應該就可以了 我是把所有序列都算進去
→ chaunen:有的protocol會只算會黏上去的部分...
→ chaunen:primer可以用 禾鑫的HAP純化 2 O.D 1mer/10元 ~3-5工作天
→ alicialai:如果怕影響結構的話可以考慮加個linker在中間
→ alicialai:54mer還好啦~我有一隻86mer的primer.. 而且是high GC
→ alicialai:照樣P得出來~ 或者考慮加一點DMSO進去解掉二級結構~
推 ad1980:可以直接加入 primers 裡，我都這樣。