[求救] 想請教一下Annexin V/7AAD跑Flow

[truthPP (就是真理)]

各位這裡的賢拜大家好
最近因為要做細胞凋亡情形監測的實驗
目前實驗室現有的材料是
PE-Annexin V
7-AAD
故打算以此兩種現有材料對細胞進行雙染上Flow
但因為我自己本身大多做單染比較多
做雙染的經驗很少
有爬過文
參考先前賢拜的方法
但設計過程仍有些問題上來請教

目前protocol暫定設定如下
凋亡細胞以UV以及誘發細胞凋亡藥物引發凋亡
1.各組取前置細胞數1x10^6
2.將細胞離心後以PBS Wash 1次
3.將細胞回溶於Annexin V binding buffer 100ul
4.加入Annexin V 10ul以及7AAD 5ul在冰上進行15分鐘染色
5.各管加入400ul binding buffer直接上機

組別部分
分為
Control部分(活細胞)
1.不染control
2.Annexin V+7AAD雙染 control

Positive control部分(死細胞)
1.Annexin V+7AAD雙染
2.Annexin V單染
3.7AAD單染

實驗組
1.UV treat後細胞 雙染
2.藥物濃度A Treat後細胞 雙染
3.藥物濃度B Treat後細胞 雙染

上flow後的校正(X軸訂為FL2-H Y軸為FL3-H)
1.先上雙染control調整至左下角象限
2.上positive control 單染annexin V看是否會出現於左下及右下象限
3.上positive control 單染7AAD 看是否會出現於左下以及左上象限
4.上Positive雙染觀察細胞坐落象限是否正確
5.上不染control看setting有沒有跑掉

問題點:
1.Protocol的部分Annexin V和7AAD可同時加入進行染色嗎?
  因為有看過別家實驗室的Protocol是先染Annexin V 15mins之後
  再加入7AAD 但也有看過同時加的 想請問這樣的用意差在哪邊?

2.染色時一般來說要在冰上還是室溫比較好?
  一種說法是冰上可以防止Protein degrade
  一種說法則是室溫時蛋白質的活性比在冰上好
  而且只染15分鐘 室溫應該不太會有太大影響

3.實驗設計Control組的部分要以活細胞為設計對象應該沒錯吧?
  因為自己本身想法是活細胞 PS不會外翻
  不會接上Annexin V
  膜也完整 7AAD不會染到核
  故以活細胞作為Control

4.Positive control的設計條件是我比較傷腦筋的
  想請問一下各位這邊會讓細胞怎麼死?要死的多極端?
  還是直接拿其中一組實驗組做positive control?

5.Flow設定調整校正順序是否有需要調整的地方?
  另外就是因為是雙染 可能會調整到compensation
  在這邊 有做過的賢拜大多是調整FL2H-FL3H%還是FL3H-FL2H?


有耳聞Annexin V+7AAD雙染設定調整是關鍵
也非常不好調
麻煩有做過的各位指導小弟一下
非常謝謝!!!!

為表感謝
回文或推文回覆者均給予200P

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 112.105.98.121
推 conective:針對compensation作回覆 當你上某單染色樣品的時候
→ conective:需要扣除的就是該顏色的偵測器 換言之上AnnexinV時是
→ conective:FL3-FL2%, 上7-AAD時是 FL2-FL3% 前面為被干擾的偵測器
→ conective:後面為干擾別的偵測器的螢光(也就是你單染的螢光)
→ conective:目的是為了排除因為螢光物質發散光譜本身彼此間的干擾
→ conective:所造成的false positive 降低雙陽性比例的誤判
推 qiet:control要使用solvent control, ex:DMSO
推 qiet:positive control用來確認機器設定和染色狀況的
→ qiet:我們就用UV treat去測.
推 qiet:染色一起染就好, 縮短時間趕快上機咖實在, 應該大多再RT