Re: [討論] 做IHC所使用的sample

[Dauthi (斬不斷的思緒)]

※ 引述《KTXNS (Yeah!大佛!)》之銘言：
: 問題是這樣 3個多月前我做了一批Tg mice肝臟石蠟切片
: 做IHC染色(B肝病毒蛋白) 結果很明顯是Positive
: 但是背景有點太深(偏紅)一直想重染 但一直到最近才有空
: 和另外一批剛切的片子一起染 結果剛切的染出positive了
: 之前切的卻沒染出來 試了兩次都一樣
: 我懷疑可能要重切 但有學長覺得應該不是這問題...
: 不過具體有什麼問題他也說不上...只叫我再試~
: (不過大家知道的...抗體不便宜阿 雖然我會recycle...)
: =========
: 想請教會做IHC的各位
: 切片到染IHC最長會擺多久 會到3個月嗎?
: 謝謝!
做過不少IHC依經驗回答一下

1.最近這次染的抗體是重新配置的還是拿上次稀釋好的重用？
這關係到抗體活性 事隔這麼久如果是以稀釋好的抗體可能早就沒活性

2.切片放置時間
這我沒辦法回答很正確的答案 這也關係到抗原蛋白的問題
但在自己以前的經驗上覺得已經被福馬林固定過的的蛋白要再變性的機會很低
通常我們在做實驗要染色的切片 如果要染的數量很大的話
都會建議一次把整個蠟塊切完 因為每次重切(如你說的會在蠟塊上封一層蠟)
都要再多削掉幾塊 這樣能染的組織片數就會減少(有些組織得來不易阿)
也這樣放過好幾個月甚至幾年都還可以染的到陽性
另外以前待的實驗室也有人做過放了十幾二十年的蠟塊(病毒性疾病)
再拿出來切片染IHC還是可以偵測的到病源 所以切片放置時間理論上應該不會受到影響

3.抗體recycle
我本身是沒有試過抗體recycle之後再繼續染色的經驗
所以關於這點想知道的是當初您有用recycle過的抗體再染一次新的切片嗎？
本身沒做過 所以比較懷疑recycle之後的抗體效力 這點有待確認

至於蠟塊切完上面會封一層蠟詳細情形我也忘了是為什麼了
印象中是怕保存時因為疏失直接傷害到組織 所以再給他一層保護

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.98.120
推 KTXNS:...你說的沒錯 recycle後的抗體效果確實會變差...
→ KTXNS:我最近這次用的也是別人最近做完recycle的...好...我再試吧
→ KTXNS:謝謝!
推 KTXNS:另外 固定太久也會影響antigen是嗎?
→ Dauthi:固定太久會 然後脫蠟時放在Xylene裡面太久也可能會
→ Dauthi:說"可能"會是要看抗原 我有放在Xylene裡面四天還是染的出來
→ Dauthi:但也有放了四個多小時忘記了 之後就完全染不出來的...
推 KerryWood:所以重點是抗原呈現那步呀
推 KTXNS:pH6.0 citrate acid autoclave 15 minutes
→ KTXNS:citric acid buffer為10mM 應該沒問題我想
→ Dauthi:抗原呈現不同抗體對不同的buffer反應都不一樣
→ Dauthi:之前實驗室有試過同一支抗體染同樣的組織 用不同的buffer
→ Dauthi:不出來的就是打死都不出來 每種buffer pH都不一樣
→ Dauthi:需要用的抗體也不同 不過如果以前用這種buffer以及同樣方法
→ Dauthi:就染的出來 那我就會往其他方面去思考
→ Dauthi:因為照原po所說的 他先前就染出來過了 所以我比較懷疑
→ Dauthi:是抗體的問題 可能先配製新的一批抗體來染看看再確定
→ goshr:同時染, 以前切的沒染出來, 新切的有染出來, 那就重切吧
→ goshr:不就只有一個變因嗎 ^^
→ goshr:不過如果你的目的是想探討為什麼以前染得出來 現在染不出來
→ goshr:那就另當別論了,
→ goshr:某個病理部的主任說過, 切片要用蠟封起來, 不然幾個月後
→ goshr:染色的效果會降低, 所以後來我幫人切TMA的片子時都會用蠟封
推 KTXNS:謝謝各位 大家的意見惠我良多阿!!
→ KTXNS:想請教 如果一個號稱可以同時染WB&IHC的抗體 如果用WB時有
→ KTXNS:一些non-specific band 那染IHC時的Positive我應該信嗎?
→ KTXNS:antigen retrieval的buffer是實驗室protocal的 我也沒想到要
→ KTXNS:換過 請問是怎樣的情況下需要考慮換Buffer呢?怎麼換 一種一
→ KTXNS:種試?還是可以在 antibody的data sheet上可以找到什麼端倪?
推 KTXNS:馴~我跟另外的學長/朋友討論過 他們有些從不recycle Ab.
→ KTXNS:有些是說如果recycle 要加一些東西 反正沒聽到有人像我這樣
→ KTXNS:的...(果然是我太摳了?我只是一天到晚廳老闆抱怨沒錢蠻慌的)