[求救] PCR某些基因P不出來

[moon2040xyz (Shivery)]

各位好 小弟是第一次發文

小弟最近一直在碰PCR的實驗

我用 1% agar跑了5種基因的PCR(內染)

當中的GAPDH(ctrl組)亮度很OK

原先雖然4個基因都跑不出來

不過後來找到並試了學姊在畢業論文留下的annealing溫度後

IL-13跟MCP-1也有跑出來(雖然亮度沒GAPDH那麼強)

可是IL-4和TNF-a不管怎麼試都試不出來

想請各位想想應對或改進的方法

以下是我嘗試過的方法:

1.cDNA加倍
2.cycle數增加 目前最高用到35個cycle
3.primer照老師的說法我們家都是用過量，所以不改(但我有重配)
4.改annealing溫度
5.跑過RNA確定有東西 cDNA的OD值以及濃度也OK

最後有一個遇到的小小問題

原先我照primer送來時附的data sheet

裡面的Tm值-1度當做annealing溫度(畢業的學姊教我這麼做)

但P不出來

雖然後來用了學姊在畢業論文裡用的anealing溫度有些成

但溫度卻比我原先使用的高了6~7度

這是為什麼呢? 小弟只知道溫度低primer會容易黏 但也容易有雜訊

麻煩各位大大囉!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 36.238.181.192
→ Invec:借得到gradient PCR machine嗎?
推 KerryWood:是P全長嘛? 只是P一小段 換另一對比較快
推 HOPEFIRE:訂好一點的primer
→ moon2040xyz:我可以借到gradient的機器 因為一開始我就是用那種的
第一次發文還不太會用請見諒...我原先是用gradient的機器跑
但後來教授跟我說用固定溫度的方式跑跑看(結果還是一樣)
此外primer我記得應該不是P全長
不過我只是個大學部學生...
不確定東西壞掉的前提下不太敢跟教授說我要訂這個訂那個...
以前教授跟我說過大學部的學生實驗做不出來
很容易第一個就懷疑reagent之類的東西而不是實驗者自己...^^"
加上我因為這問題data拖很久...(暑期計畫都變成trouble shooting...)
完全沒臉見教授啊啊啊((抓地
※ 編輯: moon2040xyz     來自: 36.238.181.192       (10/03 22:23)
推 KerryWood:不然就是去上real time PCR吧!比較靈敏
我沒試過那種測螢光的real time PCR...
會用的學長姊也畢業了...
我們家的實驗沒有大家都流通...
有些技術到我就斷了 畢業的學姊因為離開得很快我學不完~"~
剩下的一位大學姊偏向做cancer所以測的基因也不一樣
共通技術只知道步驟都一樣
現在學新實驗沒人在旁邊指導我都會有點擔心...
※ 編輯: moon2040xyz     來自: 36.238.181.192       (10/03 22:29)
推 jsi:你是拿infected sample還是mock sample?
→ skybreeze:不會的技術可以向附近實驗或者是同學打聽吧!
→ skybreeze:不然理論上前人也應該都會留下protocol
J大 不太好意思 我不太了解infected sample跟mock sample 是指什麼...
S大 我會擔心是因為我曾經請學姊教我做ROS 然後學姊讓我follow她畢業論文上寫的步驟
可是我一直跑不出來 雖然和學姊再三確定過實驗條件 結果卻一樣
後來是請別間實驗室的人教我才成功
而如果有人在旁邊指導，我想一來可以給建議 二來我有做錯可以馬上糾正
而且...我們附近實驗室幾乎都是跟癌症有關 而我在研究偏過敏的實驗室...
如果是普遍的實驗技術應該還能跟別人參考
若是只有用在研究過敏的實驗可能就得參考期刊
※ 編輯: moon2040xyz     來自: 36.238.181.192       (10/03 23:33)
推 chaunen:1%的 DMSO
→ chaunen:primer設計越靠近3"端越好 如果RT是用oligodT的話
加入1%的DMSO嗎 這個我是沒有試過
不過我跑過的那些基因 學姊以前都有成功過
雖然大概過4個月了 不過都有很好的保存在-20
所以我想primer應該也沒問題
※ 編輯: moon2040xyz     來自: 36.238.181.192       (10/04 00:04)
推 mesenchymal:那就先拿Positive control的來試條件
推 mesenchymal:還有你當初跑gradient設定溫度範圍內沒一管有產物嗎?
推 milkpa:primer如果是已經稀釋過的，拿stock重新稀釋，template是
→ milkpa:哪種？DMSO通常用於genomic DNA強迫打開用，PCR簡單也很難
→ milkpa:剛剛看到是RT，有確認過RNA的品質了嗎？
我的產物不管是positive還是negative control都看不到IL-4和TNF-a的產物...
原先是follow學姊留下來的條件 但今天打算用gradient來找適合的溫度
而primer和template我都有重新配過了 結果還是一樣
抽的RNA O.D.也沒問題 用trizol抽的OD約在1.96~2.0之間
※ 編輯: moon2040xyz     來自: 163.15.174.96        (10/04 10:35)
→ amonsh:如果primer的序列為GC-rich 則加入final 1M的betaine 試試
推 marquisnedra:片段有多大？PCR反應程序？