→ x24061837:要不要試試看 OPA法 10/19 16:06
→ divingfish:喔!!! 我原本是PITC和OPA衍生法在猶豫，因為實驗室只有 10/19 21:49
→ divingfish:UV detector 10/19 21:50
→ divingfish:所以最後選擇PITC衍生。想說以PITC衍生的文獻滿多，應 10/19 21:54
→ divingfish:該可以做出來>_< 而OPA好像要接螢光detector才能偵測 10/19 21:58
各位版友大家好：
我第一次做胺基酸衍生化，目標是將gama aminobutyric acid經PITC(phenyl
isothiocyanate)衍生化後以HPLC分析定量。但依照paper上的protocol作衍生化，一直得
不到預期的結果。
參照的步驟如下：
Standard derivatization
(減壓離心濃縮去除溶劑的過程：37 °C)
˙50λ標準品(0.0125, 0.025, 0.05 mg/mL) 減壓離心濃縮到透明
˙加入20λ coupling reagent (methanol:water:triethylamine 2:2:1)
˙混和後減壓離心濃縮到透明
˙加入30λ PITC reagent (methanol:water:triethylamine:PITC 7:1:1:1)，
於室溫下反應20分鐘
˙減壓離心濃縮去除PITC (eppendorf有白色固體殘留)
˙PITC衍生物以500λ bufferA回溶
˙經0.2λ Millipore membrane過濾
HPLC analysis
˙column: C18 reversed-phase column (Nucleodur 100-5 C18 ec 5U, 250 x 4.6 mm)
˙operating temperature 43°C
˙UV absorption spectrum：254 nm
˙以gradient進行分析
Buffer A： 0.1 M ammonium acetate
Buffer B： 0.1 M ammonium acetate:acetonitrile:methanol (44:46:10, v/v/v)
BufferA、bufferB皆以acetic acid調整pH到6.5
時間 buffer A 比列
0-12.5 min 100-75%
12.5-25 min 75-50%
25-37.5 min 50-25%
37.5-50 min 25-0%
HPLC圖譜中沒有標準品的peak。
想請問是否有版友做過胺基酸的衍生化，
可以給一些建議，或是操作上需要注意的地方。
謝謝> <
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