[求救] 抽質體測ND-1000有濃度但切酵素、PCR失敗

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小弟日前抽學長建構的質體
菌種：E.coli 質體：ptz57r/t（含需要的基因，約1500kp，總長約4200kb）

抽質體的方法是用kit抽取
在加sol I、II、III時，變化都很明顯
尤其是Sol II 樣品都有變澄清，且牽絲
之後用DI水50ul回溶

去測ND-1000 選 nucleic acid 波長230nm
樣品濃度約 60.8 ng/ul
260/280: 1.94
260/230: 2.08

但是我把樣品拿來用NdeI切，卻什麼BAN都沒看到
用PCR確認（dream Taq）也是什麼都沒有
program:
95度   〡   94度    60度     72度   〡   72度
3min   〡   2min    1.5min  1.5min  〡   30min
       〡           30 cycle        〡
primer長度約70mer
有做過測試，在正確模版下這個條件是做得出來的

想請問為何我在做抽完質體之後以ND-1000測，在有濃度而且比值、圖表都正常的情況下
做切酵素與PCR卻「一條BAN都沒有」或是「只有一條極淡色的broad BAN」
而不是在應該有東西地方有表示

小弟做了三組
其中有一組有好的結果，PCR有1200的BAN
另兩組是怎樣也做不出來

還有第二個問題就是...如果質體中僅含一個XhoI切位
我用XhoI切下去應該會變成線性的質體吧，如果切下去跑膠有兩條BAN...這代表我要重新檢查切位的設計了？

感謝



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◆ From: 140.123.126.147
※ 編輯: a72830044       來自: 140.123.126.147      (10/17 22:39)
→ roy047:loading多少量DNA跑電泳呢?
→ roy047:跑膠有兩條band也可能其中一條是沒切乾淨...看size差距
loadind dye 1ul
sample      2ul
總共load 2ul進well裡

切酵素配方：
        質體樣品 8ul
10X tango buffer 1ul
            NdeI 1ul
切4hr後，以80度失活20分鐘
load進膠片的量與上述相同

切XhoI那邊是我敘述不完整
有一條沒有切乾淨的總長約4kb
還有另外兩條分別是 2kb與 2.5kb左右
我主要是在講 2 kb與2.5kb這兩條，抱歉
※ 編輯: a72830044       來自: 140.123.126.147      (10/17 23:00)
→ micocat:抽完的plasmid直接跑膠呢？
→ Ianthegood:load多一點阿 你那個濃度2ul大概本來就看不到
→ Ianthegood:建議直接用vector的序列去定序
→ roy047:120ng其實應該看得到了...
→ roy047:第二點的話建議檢查看看  也可能所抽的含有一種以上plasmid
→ roy047:連PCR都放大不了 表示真的不知道抽到啥東西
→ roy047:也請檢查抗生素是否失效 或菌液是否搖太久 來避免搖到雜菌
原來真的會不知道抽到啥東西！
那我會再檢查我所有的藥品以及步驟再重新做幾次確認
※ 編輯: a72830044       來自: 118.163.252.247      (10/17 23:49)
推 chaunen:應該是雜菌 solution 2破菌的時候 輕輕invert幾次即可
→ chaunen:太用力Genomic DNA會斷成較小片段
看來我搖的時候應該更小心才是
謝謝樓上各位的說明！
※ 編輯: a72830044       來自: 59.127.237.168       (10/18 01:49)