Re: {求救}小鼠組織石蠟切片IHC

[chaichi (chaichi)]

※ 引述《caesar0926 (嗚哈哈)》之銘言：

: ※ 引述《chaichi (chaichi)》之銘言：
: : 我是在做小鼠眼睛的石蠟切片染色,用IHC來染色,使用ABC法,
: : 用脫蠟.vector的ABC之後再用DAB呈色再用hemoxylin染核,但是我染了很多次都沒染出訊號
: : control(沒加一抗)和有加抗體的有顏色深淺差異
: : 但從有加抗體那片我無法判斷出哪裡是有訊號的
: : 一片咖啡色,沒有一點一點的深咖啡色訊號
: : 我在做DAB呈色時,有在顯微鏡下觀察,且成色時間不長,所以應該不會背景太深
: : 而我染的組織前面的學長有做過同樣天數眼睛的IHC有染出訊號過
: : 可以確定此組織可以染出訊號
: : 我想問這樣我該怎麼辦才能染出訊號?
: : 還有我想問取下組織後泡福瑪鈴的時間長短會有影響嗎?
: : 因為一直做不出來 實在好困擾
: : 希望有人可以告訴我 謝謝
: 以前也做小鼠眼球染色(螢光和DAB呈色)
: 我覺得臘切眼球比較容易遇到的問題是 切片常常破片(lens的原因)
: 但你好像沒這方面問題
: 但是有幾個問題
: 1.你要看到位置是眼球哪個位置?角膜?視網膜?還是..?
: 2.你染的是什麼蛋白?正常表現狀況?表現位置?
: 3.脫臘的過程也會影響你的呈色?有antigen retrieval嗎?是用什麼方式?
: 你只用了兩個字帶過。(常常染不上去、背景值高可以改善這步驟)
: 4.抗體稀釋比例也會影響背景值，也沒有提供相關資訊
: 5.你用什麼固定?福馬林是formaldehyde 還是 paraformaldehyde?
: 很努力看才看懂你文章 =_=


很抱歉 細節部分打的不清楚
我切片出來的結果眼睛的水晶體視網膜都很完整
要染的蛋白質出現的地方是在視網膜以及眼外肌
我是做三天小鼠的眼睛切片 是整顆頭去做石蠟包埋切片
脫蠟的過程是xylenen三次, 酒精100% 95 % 75% 50% 30%進行覆水 d2dH2O
使用citrate acid隔水加熱進行抗原修復,再用H2O2,然後blokcking用1%BSA
抗體比例我試過一抗1000倍.500倍.200倍二抗800倍
都沒有訊號
我是用formaldehyde加上EDTA來固定





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◆ From: 114.46.217.160
推 tchan:甚麼一抗可以用到1000倍？我都用50倍~150倍以內
推 Dauthi:請問這抗體稀釋倍率是說明書上提供的嗎? 這倍率也太大了點
→ vandia:我們家抗體常用到5000x還是爆訊號...看抗體啦~ 正常
→ chaichi:我是按照之前做出來的那個學長的, 他是做1000倍,
→ chaichi:但那是兩年前的事了,我們用的抗體是自己做,的請國外純化
→ blence:自己做抗體再請國外純化？跟一般的常理不太一樣,而且純化的
→ blence:抗體可以在IHC用到1:1000? 看你要試條件,還是其實不是IHC？
推 htLiu:IHC一抗不都1:50-100嗎, 1000一定沒訊號
推 caesar0926:先測試抗體吧 拿已經發表或已知的positive control測試
推 michealking:IHC還真沒看過一抗大於200的@@
→ michealking:我也推薦先測抗體還能不能work
推 Realthugz:我這有1:500就可的Ab 印象中有更低的
→ Realthugz:不過是冷凍切片IHC就是了 再加retrieval
→ chaichi:謝謝各位的回答,我再試試抗體的條件